Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro
Summary
Nell’era dell’immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l’interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.
Abstract
I modelli di malattia complessi richiedono strumenti all’avanguardia in grado di fornire informazioni fisiologicamente e patologicamente rilevanti e fruibili e di svelare processi altrimenti invisibili. Saggi cellulari avanzati che imitano da vicino lo scenario in vivo si stanno affermando come nuovi modi per visualizzare e misurare l’interazione bidirezionale tumore-ospite che influenza la progressione del cancro. Qui descriviamo due protocolli versatili per ricreare co-colture 2D e 3D altamente controllabili in microdispositivi, imitando la complessità del microambiente tumorale (TME), sotto sorveglianza immunologica naturale e indotta dalla terapia. Nella sezione 1, viene fornito un setting sperimentale per monitorare la diafonia tra cellule tumorali aderenti e popolazioni immunitarie fluttuanti, mediante microscopia time-lapse a campo chiaro. Come scenario applicativo, analizziamo gli effetti dei trattamenti antitumorali, come i cosiddetti induttori immunogenici della morte delle cellule tumorali sul reclutamento e l’attivazione delle cellule immunitarie. Nella sezione 2, i microambienti 3D tumorali-immunitari sono assemblati in un layout competitivo. L’infiltrazione immunitaria differenziale viene monitorata mediante istantanee di fluorescenza fino a 72 ore, per valutare strategie terapeutiche combinate. In entrambi i contesti, le fasi di elaborazione delle immagini sono illustrate per estrarre una pletora di parametri delle cellule immunitarie (ad esempio, migrazione e interazione delle cellule immunitarie, risposta agli agenti terapeutici). Questi metodi semplici e potenti possono essere ulteriormente adattati per simulare la complessità della TME che comprende l’eterogeneità e la plasticità dei sottotipi di cancro, cellule stromali e immunitarie, nonché le loro reciproche interazioni come motori dell’evoluzione del cancro. La conformità di queste tecnologie in rapida evoluzione con l’imaging ad alto contenuto di cellule vive può portare alla generazione di grandi set di dati informativi, portando nuove sfide. In effetti, il triangolo “co-colture/microscopia/analisi avanzata dei dati” stabilisce il percorso verso una precisa parametrizzazione del problema che può aiutare protocolli terapeutici su misura. Prevediamo che la futura integrazione dell’on-a-chip immune al cancro con l’intelligenza artificiale per l’elaborazione ad alto rendimento rappresenterà un grande passo avanti nello sfruttare le capacità come strumenti predittivi e preclinici per l’oncologia di precisione e personalizzata.
Introduction
L’evoluzione di diverse branche della medicina come discipline sperimentali è dipesa dalla capacità di manipolare la popolazione cellulare e le funzioni degli organi in condizioni controllate1. Tale capacità ha le sue radici nella disponibilità di modelli misurabili in grado di ricapitolare i processi che avvengono nel nostro corpo.
Nell’era dell’immunoterapia e del profilo genomico unicellulare 2, la biologia del cancro deve trarre vantaggio dai modelli emergenti in vitro e computazionali per studiare l’interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato 2,3.
Il microambiente tumorale4 (TME) è un tessuto complesso in cui le cellule tumorali interagiscono continuamente e co-evolvono dinamicamente con le altre componenti cellulari (cellule immunitarie, stromali ed endoteliali) e non cellulari (matrice extracellulare, ECM). La natura dinamica di questo complesso paesaggio determina se le cellule immunitarie giocano come amiche o nemiche delle cellule maligne, influenzando così fortemente sia la progressione della malattia che la risposta alla terapia. Al giorno d’oggi, grandi sforzi da parte di onco-immunologi, bioinformatici ed esperti di biologia dei sistemi stanno convergendo per affrontare il significato clinico dell’eterogeneità del cancro 5,6, sia nello spazio (cioè in regioni tumorali distinte) che nel tempo (cioè in fasi distinte di progressione tumorale)5,6, e per caratterizzare il cancro e il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie a livello di singola cellula. Come esempio di questa sinergia, tecniche avanzate di visione artificiale sono ora utilizzate di routine per la mappatura spaziale degli infiltrati immunitari nei campioni istologici 7,8.
Sul fronte dei modelli sperimentali, collegando gli studi sugli animali e i metodi tradizionali in vitro, i progressi nella microfluidica e nelle tecniche di co-coltura danno accesso a diverse classi di modelli cellulari microingegnerizzati come organoidi, sistemi microfisiologici 9,10,11 (MPS) e organi-on-chip12,13,14 (OOC). Condividono il tratto comune di ingrandire la visione “d’insieme” degli ecosistemi cellulari e di espandere il potenziale in vitro per controllare i fattori microambientali sfruttando al contempo la microscopia ad alto contenuto15 e gli approcci di elaborazione delle immagini.
Al giorno d’oggi, i sistemi MPS e OOC all’avanguardia hanno iniziato a includere aspetti immunologici , incorporando diversi sottotipi di cellule immunitarie in tessuti e co-colture esistenti, in modo da esplorare e misurare una varietà di processi come malattie infiammatorie, guarigione delle ferite, immunità mucosale e risposta alle tossine o prodotti alimentari quotidiani16. I modelli TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, anch’essi integrati con microvasi perfusibili 18,19,20,21, sono stati sviluppati per studiare le interazioni dipendenti dal tipo di cellula, le perturbazioni fisiche e chimiche e l’attività citotossica di linfociti infiltranti22, nonché agenti immunomodulatori clinicamente rilevanti23.
Qui, forniamo protocolli versatili, che vanno dal caricamento delle cellule nei chip agli strumenti di elaborazione delle immagini, per sfruttare co-colture microfluidiche avanzate tumore-immune in impostazioni 2D (sezione 1) e 3D (sezione 2)16, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico24 e la visualizzazione delle funzioni cellulari. Ciò si ottiene mantenendo la facilità d’uso e la flessibilità sia nella gestione dei campioni che nell’analisi dei dati, sfruttando il software freeware delle Fiji e le sue cassette degli attrezzi25,26.
Il dispositivo microfluidico, descritto nella sezione 1, è progettato per eseguire co-colture 2D di cancro aderente e cellule immunitarie galleggianti. Questa piattaforma è stata validata per la misurazione in vitro del comportamento delle cellule immunitarie in presenza di mutazioni genetiche27 e/o immunodeficienze28. Qui, illustriamo i passaggi per tracciare le cellule immunitarie nelle immagini time-lapse in campo chiaro, sfruttando un metodo semi-automatico basato su Trackmate (un plugin implementato nel software Fiji). Questa procedura consente l’estrazione di descrittori cinematici della migrazione immunitaria 29 e della risposta (cioè dei tempi di interazione) alle cellule tumorali bersaglio, trattate o meno con induttori di morte cellulare immunogenica27.
È importante sottolineare che questi parametri, estratti da immagini di serie temporali, possono essere elaborati con macchinari matematici avanzati. Come esempio della potenzialità di questo approccio, i nostri gruppi hanno recentemente pubblicato un’analisi basata su metodi matematici dai processi stocastici e dalla meccanica statistica per modellare le proprietà della rete cellulare e fornire una descrizione parametrizzata del comportamento delle cellule immunitarie (cioè, camminata casuale distorta o non correlata, movimento altamente o non coordinato30,31).
L’impostazione 3D, fornita nella seconda sezione, si basa su un protocollo di co-coltura per ricreare TME immunocompetenti più complesse incorporate in due regioni di gel con diverse combinazioni di tipi cellulari e farmaci in modo competitivo. Qui, vengono descritte le fasi di elaborazione delle immagini per misurare, in diversi punti temporali, l’infiltrazione di cellule immunitarie colorate in cellule di melanoma umano A375M coltivate all’interno di Matrigel, per valutare le combinazioni di agenti antitumorali32. A375M, una linea cellulare derivata da A375P caratterizzata da un fenotipo altamente metastatico, è stata scelta per valutare la loro capacità metastatica in presenza di cellule immunitarie32.
I modelli descritti possono essere pienamente compatibili con diverse fonti cellulari (linee cellulari murine e umane immortalizzate o primarie, organoidi, xenotrapianti, tra gli altri). In recenti studi del nostro laboratorio, combinando la microscopia video ad alto contenuto con l’analisi delle immagini, il layout 3D competitivo è stato applicato per indagare: i) una risposta immunitaria antitumorale (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC) e sezionare il ruolo dei fibroblasti nella resistenza alla terapia con trastuzumab in modelli on-chip di carcinoma mammario HER2+ 33; ii) l’azione delle cellule mieloidi (cioè dei macrofagi associati al cancro) nei meccanismi di evasione tumorale e di reclutamento delle cellule T34; iii) l’efficacia di regimi immunoterapeutici, specificamente basati su cellule dendritiche (IFN-DC) condizionate da interferone α, coltivate con cellule tumorali del colon trattate con farmaci in matrici di collagene, e la valutazione del movimento efficiente e dei successivi eventi di fagocitosi35; iv) la migrazione chemiotattica di eosinofili derivati dal midollo osseo verso cellule di melanoma trattate o non trattate con IL-3336.
Questi modelli avanzati potrebbero servire come finestre di osservazione per comprendere il ruolo del contesto immunitario nelle metastasi del cancro e nei meccanismi di resistenza, ma sono necessari sforzi per tradurre i risultati nelle cliniche, colmando il divario con la ricerca di base37.
Come scenario emergente, sfruttare la potenza della microscopia automatizzata ad alto contenuto accoppiata all’uso di microsistemi più fisiologicamente rilevanti sta aprendo nuove potenziali sfide per la gestione, l’elaborazione e l’interpretazione di centinaia, e persino migliaia, di gigabyte di dati multiparametrici, che possono essere generati da una singola campagna sperimentale. Ciò implica un collegamento diretto degli esperimenti OOC con algoritmi basati sull’intelligenza artificiale 38,39,40,41,42 (AI) sia per l’analisi automatizzata avanzata, sia per la generazione di funzionalità che possono alimentare a loro volta modelli in silico di interazione cancro-immunità 43, con nuove entusiasmanti applicazioni all’orizzonte, come lo sviluppo di saggi predittivi di screening farmacologico 44.
Un flusso di sforzi in continua espansione è focalizzato sulla progettazione di modelli di malattia congiuntamente all’ottimizzazione delle strategie per implementare gli schermi di perturbazione su larga scala con letture multi-omiche a cella singola. Ciò aiuterà senza dubbio lo sviluppo e, si spera, l’implementazione clinica, accompagnata da un adeguato grado di standardizzazione del metodo, di un approccio sistematico onco-immunology-on-a-chip per ottenere nuove informazioni sui disturbi immunitari e sui meccanismi di diffusione del cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti cercano di progettare un approccio generale per ricapitolare, con grado modulabile di complessità, due aspetti significativi nel campo dell’onco-immunologia, che possono beneficiare dell’adozione di modelli in vitro più rilevanti. Il primo riguarda il lato della popolazione di cellule tumorali, dove affrontare le caratteristiche delle singole cellule può portare a una migliore descrizione dell’eterogeneità e del significato biologico e clinico correlato tra cui resistenza alla terapia, propensione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Cell culture materials | |||
| 50 mL tubes | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | centrifuge tubes |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-hypomethylating agent |
| 6-well plates | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | culture dishes |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Corning, New York, NY | 430641U | culture flasks |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 |
human melanoma cell line |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | anthracycline antibiotic |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0728L | Culture medium for SK-MEL-28 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB4004L | saline buffer solution |
| Fetal Bovine Serum | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECS0180L | ancillary for cell culture |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separation of mononuclear cells from human blood. |
| hemocytometer | Neubauer | Cell counter | |
| Heparinized vials | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Vials for venous blood collection | |
| interferon alpha-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | recombinant human cytokine |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3000D | ancillary for cell culture |
| Liquid nitrogen | |||
| Lympholyte cell separation media | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | growth factor reduced basement membrane matrix |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | human breast cancer cell line |
| Penicillin/ Streptomycin 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3001D | ancillary for cell culture |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Liquid handling |
| PKH26 Red Fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | red fluorescent cell dye |
| PKH67 Green fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | green fluorescent cell dye |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM2001L | Culture medium for MDA-MB-231 cells |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Liquid handling |
| sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | tips for micropipette |
| Timer | |||
| Trypan Blue solution | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | cell stain to assess cell viability |
| Trypsin | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0920D | dissociation reagent for adherent cells |
| Cell culture equipment | |||
| EVOS-FL fluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fluorescent microscope for living cells | |
| Humified cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2 |
| Juli Microscope | Nanoentek | ||
| Laboratory refrigerator (4 °C) | FDM | ||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Steril VBH 72 MP | Laminar flow hood | |
| Optical microscope | Zeiss | ||
| Refrigerable centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thermostatic bath | |||
| Microfabrication materials | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip |
| Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ | MB W&A, Germany | optical masks for photolithography | |
| Glass coverslip, D 263 M Schott glass, (170 ± 5 µm) | Ibidi, Germany | 10812 | |
| Hydrogen Peroxide solution 30% | Carlo Erba Reagents | 412081 | reagents for piranha solution |
| Methyl isobutyl ketone | Carlo Erba Reagents | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm | Sail Brand | 7101 | substrates for bonding chips |
| Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm | Tedpella | dermal biopsy punches for chip reservoirs | |
| PMMA 950 kDa | Allresist,Germany | AR-P. 679.04 | Positive electronic resists for patterning optical masks |
| Polymer untreated coverslips | Ibidi, Germany | 10813 | substrates for bonding chips |
| Prime CZ-Si Wafer, 4”, (100), Boron Doped | Gambetti Xenologia Srl, Italy | 30255 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba Reagents | 415238 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resists developer |
| SU-8 3005 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0001 | Negative Photoresists |
| SU-8 3050 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0005 | Negative Photoresists |
| Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | dermal biopsy punches for chip reservoirs |
| Sulfuric acid 96% | Carlo Erba Reagents | 410381 | reagents for piranha solution |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Silicone Elastomer (PDMS) |
| Trimethylchlorosilane (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | silanizing agent for SU-8 patterned masters |
| Microfabrication equipment | |||
| 100 kV e-beam litography | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| hotplate | |||
| Optical litography system | EV-420 double-face contact mask-aligner | ||
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab 80 plus system | ||
| Vacuum dessicator |
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