Mikrofluidiska samkulturmodeller för dissekering av immunsvaret i in vitro-tumörmikromiljöer

Summary

I en tid av immunterapi och encellsgenomisk profilering kräver cancerbiologi nya in vitro- och beräkningsverktyg för att undersöka tumör-immungränssnittet i ett korrekt spatiotemporalt sammanhang. Vi beskriver protokoll för att utnyttja tumörimmuna mikrofluidiska samkulturer i 2D- och 3D-inställningar, kompatibla med dynamisk, multiparametrisk övervakning av cellulära funktioner.

Abstract

Komplexa sjukdomsmodeller kräver banbrytande verktyg som kan leverera fysiologiskt och patologiskt relevanta, handlingsbara insikter och avslöja annars osynliga processer. Avancerade cellanalyser som nära efterliknar in vivo-landskap etablerar sig som nya sätt att visualisera och mäta det dubbelriktade tumör-värdsamspelet som påverkar utvecklingen av cancer. Här beskriver vi två mångsidiga protokoll för att återskapa mycket kontrollerbara 2D- och 3D-samkulturer i mikroenheter, som efterliknar komplexiteten hos tumörmikromiljön (TME), under naturlig och terapiinducerad immunövervakning. I avsnitt 1 tillhandahålls en experimentell inställning för att övervaka överhörning mellan vidhäftande tumörceller och flytande immunpopulationer, genom tidsfördröjningsmikroskopi i ljusa fält. Som ett applikationsscenario analyserar vi effekterna av anti-cancerbehandlingar, såsom de så kallade immunogena cancercelldödsinducerarna på rekrytering och aktivering av immunceller. I avsnitt 2 monteras 3D-tumörimmuna mikromiljöer i en konkurrenskraftig layout. Differentiell immuninfiltration övervakas med fluorescensbilder upp till 72 timmar för att utvärdera terapeutiska kombinationsstrategier. I båda inställningarna illustreras bildbehandlingssteg för att extrahera en mängd immuncellsparametrar (t.ex. immuncellsmigration och interaktion, svar på terapeutiska medel). Dessa enkla och kraftfulla metoder kan skräddarsys ytterligare för att simulera TME:s komplexitet som omfattar heterogeniteten och plasticiteten hos cancer-, stroma- och immuncellssubtyper, samt deras ömsesidiga interaktioner som drivkrafter för cancerevolution. Överensstämmelsen hos dessa snabbt utvecklande tekniker med levande celler med hög innehållsavbildning kan leda till generering av stora informativa dataset, vilket ger upphov till nya utmaningar. Faktum är att triangeln “samkulturer/mikroskopi/avancerad dataanalys” anger vägen mot en exakt problemparametrisering som kan hjälpa skräddarsydda terapeutiska protokoll. Vi förväntar oss att framtida integration av cancerimmun on-a-chip med artificiell intelligens för bearbetning med hög genomströmning kommer att synergisera ett stort steg framåt för att utnyttja kapaciteten som prediktiva och prekliniska verktyg för precision och personlig onkologi.

Introduction

Utvecklingen av olika grenar av medicin som experimentella discipliner har varit beroende av förmågan att manipulera cellpopulationer och organfunktioner under kontrollerade förhållanden¹. Sådan förmåga har sina rötter i tillgången på mätbara modeller som kan rekapitulera processer som händer i vår kropp.

I en tid av immunterapi och encellsgenomisk profilering 2 måste cancerbiologi dra nytta av framväxande in vitro- och beräkningsmodeller för att undersöka tumör-immungränssnittet i ett korrekt spatiotemporalt sammanhang ^2,3.

Tumörmikromiljö⁴ (TME) är en komplex vävnad där cancerceller kontinuerligt interagerar och dynamiskt samutvecklas med de andra cellulära (immun-, stroma- och endotelcelluella) och icke-cellulära (den extracellulära matrisen, ECM) komponenterna. Den dynamiska naturen i detta komplexa landskap dikterar huruvida immunceller spelar som vänner eller fiender till maligna celler, vilket starkt påverkar både sjukdomsprogression och svar på terapi. Numera konvergerar stora ansträngningar från onco-immunologer, bioinformatiker och systembiologiexperter för att ta itu med den kliniska betydelsen av cancerheterogenitet 5,6, antingen i utrymmet (dvs. i distinkta tumörregioner) och tid (dvs. vid distinkta tumörprogressionsstadier)^5,6, och för att karakterisera cancer och immuncellsfenotyp och funktion på encellsnivå. Som ett exempel på denna synergi används nu avancerade datorseende tekniker rutinmässigt för rumslig kartläggning av immuninfiltrat i histologiska prover ^7,8.

På framsidan av experimentella modeller, överbryggande djurstudier och traditionella in vitro-metoder, ger framsteg inom mikrofluidik och samodlingstekniker tillgång till olika klasser av mikrokonstruerade cellulära modeller såsom organoider, mikrofysiologiska system ^9,10,11 (MPS) och organ-on-chip^12,13,14 (OOC). De delar det gemensamma draget att zooma in den “stora bilden” av de cellulära ekosystemen och utöka in vitro-potentialen för att kontrollera mikromiljöfaktorer samtidigt som de utnyttjar mikroskopi¹⁵ med högt innehåll och bildbehandlingsmetoder.

Numera har state-of-the-art- MPS- och OOC-system börjat inkludera immunologiska aspekter , som innehåller olika subtyper av immunceller i befintliga vävnader och samkulturer, så att utforska och mäta en mängd olika processer som inflammatoriska sjukdomar, sårläkning, slemhinneimmunitet och svar på toxiner eller dagliga livsmedelsprodukter¹⁶. TME-on-a-chip modellerna 10,11,12,13,14,15,16,17, även de integrerade med perfuserbara mikrokärl 18,19,20,21, har utvecklats för att undersöka celltypsberoende interaktioner, fysikaliska och kemiska störningar och cytotoxiska aktiviteten hos Infiltrerande lymfocyter²², såväl som kliniskt relevanta immunmodulerande medel²³.

Här tillhandahåller vi mångsidiga protokoll, som sträcker sig från laddning av celler i chips till bildbehandlingsverktyg, för att utnyttja avancerade tumörimmuna mikrofluidiska samkulturer i 2D (avsnitt 1) och 3D (avsnitt 2) inställningar¹⁶, kompatibla med dynamisk, multiparametrisk²⁴ övervakning och visualisering av cellulära funktioner. Detta uppnås med bibehållen användarvänlighet och flexibilitet både i provhantering och dataanalys, med fördel av Fiji freeware-programvara och dess verktygslådor^25,26.

Den mikrofluidiska anordningen, som beskrivs i avsnitt 1, är utformad för att utföra 2D-samkulturer av vidhäftande cancer och flytande immunceller. Denna plattform validerades för in vitro-mätning av immuncellsbeteende i närvaro av genetiska mutationer²⁷ och/eller immunbrist²⁸. Här illustrerar vi steg för att spåra immunceller i time-lapse ljusfältsbilder genom att utnyttja en halvautomatisk metod baserad på Trackmate (ett plugin implementerat i Fiji-programvaran). Denna procedur möjliggör extraktion av kinematiska deskriptorer av immunmigration ²⁹ och respons (dvs. interaktionstider) för att rikta cancerceller, behandlade eller inte med immunogena celldödsinducerare²⁷.

Viktigt är att dessa parametrar, extraherade från tidsseriebilder, kan bearbetas med avancerade matematiska maskiner. Som ett exempel på potentialen i detta tillvägagångssätt publicerade våra grupper nyligen en analys baserad på matematiska metoder från stokastiska processer och statistisk mekanik för att modellera cellulära nätverksegenskaper och ge en parametrisk beskrivning av immuncellsbeteende (dvs. partisk eller okorrelerad slumpmässig gång, mycket eller inte samordnad rörelse^30,31).

3D-inställningen, som tillhandahålls i det andra avsnittet, är baserad på ett samodlingsprotokoll för att återskapa mer komplexa immunkompetenta TME inbäddade i två gelregioner med olika kombinationer av celltyper och läkemedel på ett konkurrenskraftigt sätt. Här beskrivs bildbehandlingssteg för att vid olika tidpunkter mäta infiltrationen av färgade immunceller i humana A375M-melanomceller odlade inom Matrigel, för att utvärdera kombinationer av antitumörmedel³². A375M-linjen, en A375P-härledd cellinje kännetecknad av en mycket metastatisk fenotyp valdes för att utvärdera deras metastatiska förmåga i närvaro av immunceller³².

De beskrivna modellerna kan vara helt kompatibla med olika cellkällor (murina och humana odödliga eller primära cellinjer, organoider, xenotransplantat, bland andra). I nyligen genomförda studier av vårt laboratorium, genom att kombinera höginnehållsvideomikroskopi med bildanalys, tillämpades den konkurrenskraftiga 3D-layouten för att undersöka: i) ett antitumöralt (antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet, ADCC) immunsvar och dissekera fibroblasternas roll i resistens mot trastuzumabbehandling i HER2 ⁺ bröstcancer on-chip-modeller³³; ii) verkan av myeloida celler (dvs cancerassocierade makrofager) i mekanismer för tumörflykt och rekrytering av T-celler³⁴; iii) effekten av immunterapeutiska regimer, specifikt baserade på interferon-α-konditionerade dendritiska celler (IFN-DCs), odlade med läkemedelsbehandlade koloncancerceller i kollagenmatriser, och för att utvärdera effektiv rörelse och efterföljande fagocytoshändelser³⁵; iv) den kemotaktiska migrationen av benmärgshärledda eosinofiler mot IL-33-behandlade eller obehandlade melanomceller³⁶.

Dessa avancerade modeller kan fungera som observationsfönster för att förstå immunkontexturens roll i cancermetastaser och resistensmekanismer, men ansträngningar krävs för att översätta fynd till klinikerna och stänga klyftan med grundforskning³⁷.

Som ett framväxande scenario öppnar utnyttjandet av kraften i automatiserad mikroskopi med högt innehåll i kombination med användningen av mer fysiologiskt relevanta mikrosystem nya potentiella utmaningar för hantering, bearbetning och tolkning av hundratals, och till och med tusentals, gigabyte multiparametriska data, som kan genereras från en enda experimentell kampanj. Detta innebär en direkt koppling av OOC-experiment med artificiell intelligens 38,39,40,41,42 (AI)-baserade algoritmer både för avancerad automatiserad analys och generering av funktioner som i sin tur kan matas in silico-modeller av cancer-immun samspel⁴³, med spännande nya tillämpningar vid horisonten^, såsom utveckling av prediktiva läkemedelsscreeninganalyser ⁴⁴.

Ett ständigt växande flöde av insatser är inriktat på design av sjukdomsmodeller tillsammans med optimering av strategier för att implementera storskaliga störningsskärmar med encelliga multi-omics-avläsningar. Detta kommer utan tvekan att bidra till utvecklingen och, förhoppningsvis, det kliniska genomförandet, åtföljt av en lämplig grad av metodstandardisering, av en systematisk onkoimmunologi-on-a-chip-strategi för att få nya insikter om immunsjukdomar och mekanismer för spridning av cancer.

Protocol

1. Chipdesign för vidhäftande och flytande celler 2D-samkulturer 2D-samkulturlayouten (figur 1A-C) kännetecknas av tre kammare (100 μm höga) sammankopplade med två uppsättningar mikrokanalmatriser (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). Mellankammaren bildar två slutna återvändsgränder som blockerar flytande immunceller som flödar över i tumörstället under laddningssteg 2….

Representative Results

Tumörimmuninfiltration är en parameter för värdens antitumörsvar. Tumörer är heterogena i sammansättning, densitet, plats och funktionellt tillstånd för infiltrerande leukocyter vilka interaktioner med cancerceller kan ligga till grund för kliniskt relevant information för att förutsäga sjukdomsförlopp och svar på terapi. I detta avseende kan mikrofluidisk teknik användas som komplementära och privilegierade in vitro-verktyg för att utforska tumörers immunkontext, samt för att övervaka svaret på ca…

Discussion

De beskrivna metoderna försöker utforma ett allmänt tillvägagångssätt för att rekapitulera, med modulerbar grad av komplexitet, två viktiga aspekter inom onkoimmunologin, som kan dra nytta av antagandet av mer relevanta in vitro-modeller. Den första handlar om tumörcellspopulationssidan, där hantering av enskilda cellegenskaper kan leda till en bättre beskrivning av heterogenitet och korrelerad biologisk och klinisk betydelse inklusive resistens mot terapi, propension till metastasering, stamcell och differen…

Materials

Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator