फेकल (माइक्रो) आरएनए अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल पशु और मानव विषयों के फेकल नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को अलग करता है। एक वाणिज्यिक एमआईआरएनए अलगाव किट का उपयोग अनुकूलित मात्रा और गुणवत्ता के साथ शुद्ध आरएनए को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण अनुकूलन के साथ किया जाता है। आरएनए आइसोलेट्स अधिकांश डाउनस्ट्रीम आरएनए परख जैसे अनुक्रमण, माइक्रो-सरणी और आरटी-पीसीआर के लिए अच्छे हैं।
Abstract
यह स्पष्ट हो रहा है कि आरएनए जानवरों और मनुष्यों में आंत लुमेन और मल में मौजूद है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पशु और मानव विषयों के फेकल नमूनों से माइक्रोआरएनए सहित कुल आरएनए को अलग करता है। इसका उद्देश्य आरएनए अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और माइक्रो-सरणी जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च शुद्धता और मात्रा के साथ कुल आरएनए को अलग करना है। एमआईआरएनए अलगाव में इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के फायदे वर्णित अतिरिक्त धोने के चरणों के साथ अत्यधिक शुद्ध आरएनए उत्पादों को अलग करने की क्षमताएं हैं, नमूने के पुन: निलंबन में एक बेहतर विधि के साथ प्राप्त आरएनए की मात्रा में वृद्धि, और परिशोधन के महत्वपूर्ण सुझाव। एक सीमा 200 मिलीग्राम से अधिक के बड़े नमूने को संसाधित करने और शुद्ध करने में असमर्थता है क्योंकि ये नमूना आकार इंटरफेज़ के स्पष्ट गठन में कठिनाई पैदा करेंगे। नतीजतन, बड़े नमूने का आकार कार्बनिक पदार्थों के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित जलीय चरण को दूषित कर सकता है जो अंत में पृथक आरएनए की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। हालांकि, 200 मिलीग्राम तक के नमूने से आरएनए आइसोलेट्स अधिकांश डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त हैं।
Introduction
एक्स्ट्रासेल्युलर आरएनए को एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचाना जा रहा है जो कई जैविक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता करता है। मल में एक्स्ट्रासेल्युलर आरएनए को पहली बार 2008 में बृहदान्त्र कैंसर और सक्रिय अल्सरेटिव कोलाइटिस2 के लिए एक मार्कर के रूप में रिपोर्ट किया गया था, और यह हाल ही में आंत लुमेन और मल के एक सामान्य घटक के रूप में सामने आया था और मेजबान-माइक्रोब संचार 3,4,5 की मध्यस्थता करता है। इस आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल का उद्देश्य पशु और मानव विषयों से एकत्र किए गए फेकल नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले बाह्य आरएनए को निकालना है। प्रोटोकॉल को एक वाणिज्यिक एमआईआरएनए आइसोलेशन किट से अनुकूलित किया गया था। अधिग्रहित आरएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण जैसे आरएनए अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और माइक्रो-सरणी के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल में जानवरों और मनुष्यों के मल में पाए जाने वाले आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए कई महत्वपूर्ण और उपयोगी सुझाव शामिल हैं। आरएनए (माइक्रोआरएनए सहित) अलगाव की इस विधि को विकसित करने और अनुकूलित करने का कारण मल में माइक्रोबियल आरएनए को कम करना, अनुसंधान अध्ययनों में चर को सीमित करना और विभिन्न भ्रामक कारकों और संदूषण के स्रोतों को लेखांकन किए बिना आंत में आरएनए संरचना का विश्लेषण करना है। ध्यान दें, यह आरएनए अलगाव जीवित कोशिका और जीवित रोगाणुओं (सेलुलर आरएनए) से आरएनए की रिहाई को कम करता है। यह बाह्य आरएनए पर केंद्रित है जो आंत कोशिकाओं द्वारा जारी किए गए हैं या भोजन सेवन के माध्यम से अधिग्रहित किए गए हैं। मुख्य रूप से, यह विधि उन अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं है जहां माइक्रोबियल ट्रांसस्क्रिप्टम की जांच की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अलगाव 7 के दौरान RNase संदूषण को रोकने के लिए RNase-मुक्त तकनीक का उपयोग करना महत्वपूर्णहै। सेंट्रीफ्यूजेशन और एक कॉम्पैक्ट इंटरफेज के गठन के बाद, जलीय चरण को पुनर्प्राप्त करते समय जलीय चरण के शीर्ष ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हमें बायोएनालाइज़र के लिए हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में बायोपॉलिमर सुविधा से तकनीकी सहायता मिली। इस काम को नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी रिसर्च ग्रांट आरजी -1707-28516 (एचएलडब्ल्यू और एसएल) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
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