분변(마이크로) RNA 분리
Summary
이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리는 시퀀싱, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.
Abstract
RNA가 동물과 인간의 장 내강과 대변에 존재한다는 것이 분명해지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 microRNA를 포함한 전체 RNA를 분리합니다. 목표는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석을 위해 총 RNA를 고순도 및 양으로 분리하는 것입니다. miRNA 분리에서 이 최적화된 프로토콜의 장점은 설명된 추가 세척 단계를 통해 고도로 정제된 RNA 생성물을 분리하는 기능, 샘플 재현탁에서 개선된 방법으로 얻은 RNA의 양 증가, 중요한 오염 제거 팁입니다. 한 가지 한계는 이러한 샘플 크기가 간기의 명확한 형성에 어려움을 야기하기 때문에 200mg 이상의 더 큰 샘플을 처리하고 정제할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 큰 샘플 크기는 프로토콜에 설명된 대로 추출될 수성상을 최종적으로 분리된 RNA의 품질에 영향을 미치는 유기물로 오염시킬 수 있습니다. 그러나 최대 200mg의 샘플에서 분리 된 RNA는 대부분의 다운 스트림 분석에 충분합니다.
Introduction
세포외 RNA는 많은생물학적 과정을 매개하는 중요한 인자로 인식되고 있다1. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암 및 활동성 궤양성 대장염2의 마커로 처음 보고되었으며, 최근에는 장내강 및 대변의 정상 성분으로 밝혀졌으며 숙주-미생물 소통 3,4,5를 매개합니다. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집 한 분변 샘플에서 고품질 세포 외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 채택되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA (microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변의 미생물 RNA를 줄이고 연구 연구의 변수를 제한하며 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장의 RNA 구성을 분석하기 위해서입니다. 참고로, 이 RNA 분리는 살아있는 세포 및 살아있는 미생물(세포 RNA)에서 RNA의 방출을 최소화합니다. 장 세포에서 방출되거나 음식 섭취를 통해 획득 된 세포 외 RNA에 중점을 둡니다. 원칙적으로이 방법은 미생물 전사체를 조사하는 연구에는 적합하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분리 7 동안 RNase 오염을 방지하기 위해 RNase가없는 기술을 사용하는 것이중요합니다. 원심분리 및 조밀한 간상의 형성 후, 성상을 회수할 때 간상, 하부상 및 수성상 상단에 떠 있는 입자 오염 물질을 피하는 것이 중요합니다. 또한 500μL 및 250μL 세척액 2/3을 사용한 두 가지 세척 단계가 추가되어 최적화된 품질을 위해 필터 멤브레인의 오염 물질을 제거합니다. 또한, 200mg 이상의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 하버드 의과 대학의 바이오 폴리머 시설에서 바이오 분석기에 대한 기술 지원을 받았습니다. 이 연구는 국립 다발성 경화증 학회 연구 보조금 RG-1707-28516 (HLW 및 SL)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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