该协议展示了使用表型微阵列(PM)技术平台来定义 衣原体reinhardtii( 一种绿色微藻)的代谢需求,并完善现有的代谢网络模型。
代谢模型根据生物体可用的基因组注释进行重建,并提供预测工具来研究系统级的代谢过程。基因组规模的代谢模型可能包括间隙以及未经实验验证的反应。由于这些间隙,新分离的微藻物种的重建模型将导致弱点,因为通常有稀疏的生化证据可用于这些分离物的代谢。表型微阵列(PM)技术是一种有效的高通量方法,可响应于各种进入代谢物的功能性确定细胞代谢活动。将高通量表型测定与代谢建模相结合,可以通过提供生化证据来支持和扩展基因组证据,从而快速重建或优化现有的代谢网络模型。这项工作将通过使用绿色微藻模型物种 衣原体reinhardtii 作为示例,展示PM测定在微藻研究中的使用。本研究使用PM获得的超过254种反应的实验证据来扩展和完善基因组规模 的C. reinhardtii 代谢网络模型 iRC1080,大约25%。这里创建的方案可以用作功能分析其他微藻代谢的基础,包括已知的微藻突变体和新分离物。
优化藻类代谢以增强和稳定地生产靶向代谢物需要通过代谢网络的系统级分析来开发复杂的代谢工程策略。代谢网络模型可以指导合理设计,用于优化策略1、2、3、4的快速发展。虽然大约160种微藻物种已经测序5,但据我们所知,只有44种藻类代谢模型可用4,6,7。由于难以获得用于基因组信息实验验证的高通量代谢表型数据,高质量网络模型的重建滞后于藻类基因组测序的快速发展。
C. reinhardtii是一个有吸引力的基于藻类研究的模型系统。该物种可以光自养或异养生长,并已被广泛用作基础和应用研究中的模式生物。它的基因组序列发表于2007年8,随后重建了9、10、11物种的基因组规模代谢模型。C. reinhardtii(i RC1080)的基因组尺度模型由Chang等人重建。 10个基于基因组和文献证据(需要约250个来源)。它有1,706个代谢物,2,190个反应10;然而,除了当时已发表的实验证据之外,无法验证该模型的完整性。
表型微阵列(PMs)技术是一种高通量平台,可以为异养微生物以及组织培养细胞提供代谢分析信息。特别是,它可用于解决微藻中的表型间知识差距,如首次报道的衣原体reinhardtii12以及随后的氯铱13和小球藻14物种。通过研究细胞对数千种代谢物,信号分子,渗透压分解物和效应分子的反应,PM测定可以提供功能代谢分析,并提供对功能,代谢和环境敏感性的见解15,16,17。具体而言,PM测定检测96孔微孔板中的细胞代谢物利用,每个孔中含有不同的营养物质,代谢物或渗透压解质。此外,还可以测定生物活性分子,例如抗生素和激素。由基于四唑的氧化还原染料的NADH还原产生的颜色强度确定,底物的代谢利用根据细胞呼吸15,16,17进行评估。96孔微孔板中的实验可以通过表型微阵列仪(PMI)平台随时间自动监测和确定。设计了20个96孔微孔板,以代表常见的代谢物,以研究细胞表型以利用碳,氮,硫和磷源,以及不同的渗透/离子和pH效应。PM技术已成功用于更新和升级一些现有的微生物基因组尺度代谢模型15、16、17、18。
这里显示的协议和数据基于Chaiboonchoe等人先前发表的工作 。12所提出的工作详细介绍了使用PM测定方法来表征微藻的代谢表型,并扩展 了C. reinhardtii 的现有藻类代谢模型以及指导新代谢模型的重建。
绿色微藻 C. reinhardtii的代谢表型在这里使用高通量PM测定板和未修饰的PMI进行描述。这些测定共用于190个碳源(PM01和PM02),95个氮源(PM03),59个磷源和35个硫源(PM04),以及肽氮源(PM06-08)。对148种营养素观察到正呼吸(C源利用一次阳性测定,S源和P源利用各4次阳性测定,以及139次N源利用阳性测定)。当应用于测试每种来源的相关PM微孔板时,不应将介质的底物或营养物质(碳,氮,磷或硫)组分添加到定义的介质中。
这里显示的方法对于表征可用于扩展现有代谢网络模型或指导新模型重建的代谢微藻表型是有效的。此外,由于大多数微藻的营养需求尚不清楚,该平台可用于快速定义这些微藻。纳尔逊 等人。43成功地应用了这些方法来鉴定支持微藻 Chlorodiium sp. UTEX 3007生长的新化合物,并使用获得的信息来定义物种进入代谢物,与衣原体不同,它包括40种不同的碳源。
PM用于分析微藻的一个主要限制是PMI在孵育室中没有照明,并且微藻需要能够进行异养代谢。光的缺乏可能会影响对包含光来计算代谢通量的模型的解释。具有协调功能的基因对已经共同进化为构成代谢网络枢纽,并且可以区分光合和非光合网络枢纽44。通常,光合网络集线器(即模型中高度连接的节点)将被排除在异养模型之外。出于实际目的,模拟混合营养物种中的异养性应省略已知由光驱动的反应,并考虑条件之间的能量平衡差异。因此,模拟光依赖性和光无关代谢是衣原体代谢建模的标准做法6,45。
一些绿色微藻,如Trebouxiophytes,已知会同化各种碳分子以进行生长,这被认为是从它们作为地衣成员的漫长进化历史46中产生的。虽然像衣原体这样的叶绿植物可以使用乙酸盐进行生长,但棕色海洋微藻Tisochrysis lutea以其商业生产超长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFAs)的潜力而闻名,不能使用乙酸盐,但可以使用甘油进行生长47。使用小球藻在进料批次模式下优化添加有机碳源,实现了超过100 g l−1干细胞重量的生物质浓度。此外,向小球藻中添加糖可以提高其对CO2的封存,从而在光合生长期间提供添加剂益处49。大多数异养微藻也可以混合营养生长,但叶绿体铬藻已被证明在添加糖50时会关闭光合作用。
硅藻,属于Bacillariophyta部门,是浮游植物的主要群体。虽然大多数硅藻只能光自养生长,但其中一些可以混合养或异养培养51。例如,发现甘油在一些硅藻中没有CO2的情况下支持光照下的生长,包括模型物种 Phaeodactylum tricornutum52。此外,一些底栖硅藻,如 Nitzschia linearis 可以在黑暗中的碳水化合物上生长53。通过补充合适的有机碳源,可以将PM测定扩展到硅藻和其他藻类,以使细胞异养生长,并且混合营养策略也可以潜在地用于专性自养微藻,提供最低限度的光供应。
为了评估数据的再现性,强烈建议对所有板进行重复测定。只有当从阴性对照和相应的空白孔中减去吸光度(PMI值)为正时,才能将测定视为阳性。在测试化合物存在的情况下,这种描述反映了染料与介质的非生物反应。
The authors have nothing to disclose.
这项工作的主要支持由NYUAD基因组学和系统生物学中心(CGSB)提供,该中心由Tamkeen在纽约大学阿布扎比研究所资助(73 71210 CGSB9)和纽约大学阿布扎比学院研究基金(AD060)资助下提供。W.F.还得到了浙江大学百人计划的支持。我们感谢Ashish Jaiswal帮助录制视频。我们感谢蔡宏生成代谢表型数据。
Ampicillin | VWR | 97062-796 | |
Biolog assay plates [ PM01-08] | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Biolog Omnilog Instrument | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 | Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. | Regents of the University of Minnesota | |
Kanamycin | VWR | 0408-EU-10G | |
Tetrazolium Violet Dye “D” | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Timentin | GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd | 42010012-2 |