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Bioengineering

ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए एक सरल और बहुमुखी रोशनी प्रणाली का निर्माण

Published: January 12, 2021 doi: 10.3791/61914
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 4, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि PhyB और PIF3 का उपयोग करके लाल और दूर-लाल प्रकाश के साथ जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग कैसे करें। एक सरल और लचीली रोशनी प्रणाली के निर्माण के लिए चरण-दर-चरण निर्देश शामिल हैं, जो कंप्यूटर के साथ जीन अभिव्यक्ति या अन्य ऑप्टोजेनेटिक्स के नियंत्रण को सक्षम बनाता है।

Abstract

प्रकाश का उपयोग करके जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने से सटीकता और गति में वृद्धि हुई है जिसके साथ शोधकर्ता कई जैविक प्रक्रियाओं में हेरफेर कर सकते हैं। ऑप्टिकल नियंत्रण कार्य को विच्छेदित करने की अभूतपूर्व क्षमता की अनुमति देता है और नवीन आनुवंशिक उपचारों को सक्षम करने की क्षमता रखता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को स्थानिक, अस्थायी या तीव्रता नियंत्रण के साथ पर्याप्त प्रकाश स्रोतों की आवश्यकता होती है, जो अक्सर शोधकर्ताओं के लिए एक अड़चन होती है। यहां हम विस्तार से बताते हैं कि कम लागत और बहुमुखी एलईडी रोशनी प्रणाली कैसे बनाई जाए जो विभिन्न उपलब्ध ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के लिए आसानी से अनुकूलन योग्य है। यह प्रणाली समायोज्य एलईडी तीव्रता के साथ मैन्युअल या कंप्यूटर नियंत्रण के लिए कॉन्फ़िगर करने योग्य है। हम सर्किट के निर्माण, इसे कंप्यूटर-नियंत्रित बनाने और एलईडी के निर्माण के लिए एक सचित्र चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं। इस उपकरण की असेंबली को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम कुछ बुनियादी सोल्डरिंग तकनीकों पर भी चर्चा करते हैं और एलईडी को नियंत्रित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सर्किटरी की व्याख्या करते हैं। हमारे ओपन-सोर्स यूजर इंटरफेस का उपयोग करके, उपयोगकर्ता व्यक्तिगत कंप्यूटर (पीसी) या एक सस्ती टैबलेट पर प्रकाश के सटीक समय और स्पंदन को स्वचालित कर सकते हैं। यह स्वचालन सिस्टम को उन प्रयोगों के लिए उपयोगी बनाता है जो जीन, सिग्नलिंग मार्गों और अन्य सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए एलईडी का उपयोग करते हैं जो बड़े समय के पैमाने पर फैले होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक सभी भागों का निर्माण करने या ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को करने के लिए रोशनी प्रणाली का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स में कोई पूर्व विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है।

Introduction

ऑप्टोजेनेटिक उपकरण सर्वव्यापी होते जा रहे हैं और जीन अभिव्यक्ति, सेल सिग्नलिंग और कई और 1,2,3 जैसे जैविक प्रक्रियाओं को ऑप्टिकल रूप से नियंत्रित करने के लिए नई तकनीक लगातार विकसित की जा रही है। प्रकाश के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने की क्षमता तेजी से कैनेटीक्स, तंग स्थानिक नियंत्रण और खुराक-निर्भर विनियमन की अनुमति देती है जिसे प्रकाश तीव्रता और एक्सपोजर समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इन उपकरणों का उपयोग करने के लिए, इन मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए एक उपकरण आवश्यक है। हमने हाल ही में एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड PhyB-PIF3 स्तनधारी जीन स्विच विकसित किया है जो क्रमशः लाल / दूर-लाल प्रकाश का उपयोग करके जीन को सक्रिय और निष्क्रिय करताहै। इस प्रणाली का परीक्षण कई स्तनधारी सेल लाइनों में किया गया था और प्रकाश की दालों सहित प्रकाश की बहुत कम मात्रा के साथ भी जीन अभिव्यक्ति के अद्वितीय प्रेरण को सक्षम किया गया था। PhyB स्विच और इसी तरह के उपकरण 5,6 का उपयोग करने के इच्छुक शोधकर्ता अक्सर रोशनी की तीव्रता और अवधि को नियंत्रित करने के तरीकों पर जानकारी का अनुरोध करते हैं। इसलिए, हमने ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए इन उपकरणों को व्यापक रूप से अपनाने में सक्षम करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देशों के साथ इस प्रोटोकॉल को विकसित किया।

एलईडी के व्यापक उपयोग से पहले, फिल्टर के साथ ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोतों का उपयोग फाइटोक्रोम 7 जैसे प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए कियागया था। हाल ही में, कुछ एलईडी रोशनी प्रणालियों को ऑप्टोजेनेटिक टूल्स 8,9,10,11,12 के साथ प्रकाशित किया गया है, लेकिन उन प्रोटोकॉल को इलेक्ट्रॉनिक्स / सॉफ्टवेयर में महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता हो सकती है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है (जैसे, 3 डी प्रिंटर, लेजर कटिंग मशीन, या फोटोमास्क), या चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान नहीं करते हैं जिन्हें कुछ शोधकर्ताओं को अपनी शोध आवश्यकताओं के लिए तैनात करने की आवश्यकता होगी। जबकि एक मल्टीवेल प्लेट में व्यक्तिगत कुओं का स्वतंत्र नियंत्रण उपयोगी हो सकता है, यह अक्सर अनावश्यक होता है जब शोधकर्ताओं को केवल प्रकाश और अंधेरे या लाल प्रकाश बनाम दूर-लाल प्रकाश में कई अलग-अलग नमूनों की तुलना करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सीमित अनुकूलन क्षमता के साथ कई मौजूदा वाणिज्यिक प्रणालियां महंगी हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एलईडी लागत प्रभावी, उज्ज्वल हैं, और कई तरीकों से लगाए जा सकते हैं; इसलिए, उनका उपयोग कई अलग-अलग प्रकार के नमूनों को रोशन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल और प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ, पराबैंगनी (यूवी) से लेकर एनआईआर तक के एलईडी का उपयोग यूवीआर 813,14, ड्रोंपा 15,16, एलओवी डोमेन 17,18, स्टेप फंक्शन ऑप्सिन 19,20, क्राई 21,22, फाइब 4,23,24 का उपयोग करके ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित किया जा सकता है। , 25, बैक्टीरियल फाइटोक्रोम 26,27,28,29 और अन्य प्रकाश-उत्तरदायी प्रणाली 30,31,32।

यह प्रोटोकॉल प्रकाश उत्तेजना के लिए विभिन्न मापदंडों के साथ-साथ एक ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग चलाने के लिए आणविक / सेलुलर उपकरणों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक सर्किट और अन्य हार्डवेयर की असेंबली के लिए एक ट्यूटोरियल का गठन करता है। इसके अलावा, हम किरियाकाकिस एट अल.4 से अनुकूलित प्लास्मिड की रिपोर्ट करते हैं जो क्लोनिंग के लिए छोटे और अधिक स्थिर हैं। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से, इलेक्ट्रॉनिक्स और प्रकाशिकी में विशेषज्ञता के बिना जीवविज्ञानी रोशनी प्रणालियों का निर्माण कर सकते हैं जो लचीले और मजबूत हैं। चरण-दर-चरण फैशन में, हम दिखाते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को व्यापक रूप से अपनाने के लिए तकनीकी बाधा को दूर करते हुए एलईडी सिस्टम का निर्माण कैसे किया जाए। इस प्रणाली का उपयोग आसानी से अधिकांश सेल कल्चर इनक्यूबेटरों में किया जा सकता है, भले ही उनमें तार पोर्ट न हों। उदाहरण के लिए, हमने एलईडी सिस्टम को 6 महीने से अधिक समय तक लगातार ह्यूमिडिफायर सीओ2 इनक्यूबेटर में रखा है, जिसमें प्रदर्शन में कोई कमी नहीं आई है। हम यह भी बताते हैं कि एलईडी सिस्टम को कंप्यूटर से कैसे कनेक्ट किया जाए और इसे ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के साथ इंटरफ़ेस किया जाए जो हम GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) पर प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक प्रणाली का निर्माण शोधकर्ताओं को संभावित मुद्दों को डीबग करने, भागों को बदलने और कार्यक्षमताओं में सुधार / विस्तार करने के लिए बुनियादी ज्ञान प्रदान करता है।

सिस्टम अवलोकन

रोशनी प्रणाली के निर्माण में (1) इलेक्ट्रॉनिक सर्किट का निर्माण, (2) बाह्य उपकरणों (बिजली आपूर्ति कॉर्ड, पावर स्विच, आदि) का निर्माण, (3) एलईडी का निर्माण, (4) इन सभी घटकों को इकट्ठा करना, और (5) उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ एलईडी को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित करना शामिल है (चित्रा 1 ए)। एक बार पूरा होने के बाद, रोशनी प्रणाली एक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (चित्रा 1 बी) के साथ स्वतंत्र रूप से चार एलईडी को नियंत्रित कर सकती है। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रत्येक एलईडी को निर्दिष्ट समय अंतराल पर पल्स करने और निर्दिष्ट समय के बाद बंद करने में सक्षम बनाता है। एक निर्दिष्ट समय पर रोशनी कार्यक्रम शुरू करने के लिए एक स्टार्ट-देरी भी है। पोटेंशियोमीटर (पीओटी) प्रत्येक एलईडी की तीव्रता को स्वतंत्र रूप से नियंत्रित करते हैं या कंप्यूटर के बिना मैन्युअल एलईडी नियंत्रण के लिए उपयोग किया जा सकता है। एलईडी के तार किसी भी कस्टम लंबाई हो सकते हैं, जिससे उन्हें आसानी से इनक्यूबेटर या लैब स्पेस में रखा जा सकता है। इन एलईडी की उच्च शक्ति के कारण, उनका उपयोग दूर से एकल एलईडी के साथ एक बड़े क्षेत्र को रोशन करने के लिए किया जा सकता है।

एलईडी ड्राइवर विवरण

एलईडी की तीव्रता को शक्ति और नियंत्रित करने के लिए, यह प्रोटोकॉल "एलईडी ड्राइवर" बनाने के चरणों से गुजरेगा। प्रत्येक एलईडी में वोल्टेज की एक श्रृंखला होती है जिसमें यह संचालित होता है (चित्रा 1 सी)। ऑपरेशन के दौरान, नियामक का आउटपुट वोल्टेज, जो प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करता है, को पोटेंशियोमीटर द्वारा ट्यून किया जा सकता है। पीओटी प्रतिरोध को बदलता है, आउटपुट वोल्टेज / चमक को समायोजित करता है। 1kH (1 किलो-ओम) POT के साथ ट्यूनिंग वह देती है जिसे हम "उच्च वोल्टेज सर्किट" कहते हैं और इसकी सीमा 1.35 V से 2.9 V होती है। चूंकि 2.9 V कम वोल्टेज LED (चित्रा 1C) के संचालन के लिए बहुत अधिक है, इसलिए हम एक एकल संशोधन (प्रतिरोधक 3 या "R3" पूरक चित्र 1A) दिखाते हैं जो कम वोल्टेज LED से मेल खाने की सीमा को सीमित करता है। आर 3 पोटेंशियोमीटर के समानांतर एलईडी पर लागू अधिकतम वोल्टेज को 1.85 वी ( पूरक चित्र 8 में विस्तृत असेंबली) तक कम करने का कार्य करता है। करंट के बजाय चमक को नियंत्रित करने के लिए वोल्टेज का उपयोग करके, सिस्टम विभिन्न ऑपरेटिंग वोल्टेज वाले एलईडी के लिए अधिक लचीला है। चित्रा 1 सी में इष्टतम सर्किट चयन का मार्गदर्शन करने के लिए उच्च और निम्न वोल्टेज एलईडी की एक सूची है। यह डिज़ाइन न्यूनतम वोल्टेज को काफी कम रखता है ताकि पोटेंशियोमीटर बंद होने पर एलईडी पूरी तरह से बंद हो जाए और वोल्टेज को एलईडी के विशिष्ट ऑपरेटिंग वोल्टेज से ऊपर जाने की अनुमति न दे। PhyB ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए, हम गहरे लाल और दूर-लाल एलईडी का उपयोग करते हैं, जो कम वोल्टेज सर्किट का उपयोग करते हैं।

एलईडी कंप्यूटर नियंत्रण प्रणाली विवरण

एलईडी रोशनी प्रणाली का उपयोग कंप्यूटर या माइक्रोकंट्रोलर के बिना निरंतर रोशनी के लिए किया जा सकता है। हालांकि, स्पंदन कार्यक्रमों के लिए और व्यक्तिगत एलईडी समय को नियंत्रित करने के लिए, एक माइक्रोकंट्रोलर स्थापित किया जाना चाहिए। एलईडी को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोकंट्रोलर का उपयोग करने के लिए, माइक्रोकंट्रोलर को सर्किट से जोड़ने के लिए एक ट्रांजिस्टर की आवश्यकता होती है। यह ट्रांजिस्टर माइक्रोकंट्रोलर से वोल्टेज को महसूस करता है और प्रवाहकीय या इन्सुलेट होने से स्विच करता है। "ऑन" और "ऑफ" को नियंत्रित करने के लिए, हम आर 2 (पूरक चित्रा 1 ए) में एक नियंत्रणीय शंट के रूप में "एनपीएन स्विचिंग टाइप ट्रांजिस्टर" (2 एन 2222) नामक का उपयोग करते हैं। जब माइक्रोकंट्रोलर से वोल्टेज ट्रांजिस्टर बेस पर लागू होता है, तो ट्रांजिस्टर प्रवाहकीय हो जाता है और एलईडी को बंद कर देता है, एलईडी वोल्टेज को कम कर देता है। इस प्रकार, एलईडी और ट्रांजिस्टर ऑन और ऑफ स्टेट्स को सीधे माइक्रोकंट्रोलर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसे पीसी पर स्थापित सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

रोशनी प्रणाली बनाने के लिए, निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता होती है: विद्युत सर्किट का निर्माण; बिजली की आपूर्ति, मैनुअल पावर स्विच, पीओपीटी और माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन का निर्माण; एलईडी का निर्माण; रोशनी प्रणाली को फिट करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स को समायोजित करें; सभी तारों और उपकरणों को कनेक्ट करें; एलईडी नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्थापित करें, प्रकाश के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें; दोहरी ल्यूसिफेरस परख का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को मापें।

Protocol

1. विद्युत सर्किट का निर्माण करें

नोट: उपलब्ध एलईडी के लिए एकल सर्किट बनाने के लिए प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। इसे चार एलईडी तक विस्तारित करने के निर्देश पूरक जानकारी में शामिल हैं।

  1. धूम्रपान अवशोषक और सोल्डरिंग आयरन चालू करें। पोंछने वाले स्पंज में पानी जोड़ें, सोल्डर हाथ में लें।
    सावधानी: धुएं को हटाने और जलने से रोकने के लिए सुरक्षा सावधानी बरतना सुनिश्चित करें।
  2. पूरक पैनलों में दिखाए गए क्रम में मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी बोर्ड) के लिए सोल्डरिंग सर्किट घटक शुरू करें।
    नोट: घटक और पीसीबी बोर्ड की धातु को पहले गर्म करने के लिए सोल्डरिंग आयरन टिप पर सोल्डर की एक छोटी मात्रा का उपयोग करें और घटकों पर सीधे अतिरिक्त सोल्डर पिघलाएं; फ्लक्स बहुत मदद कर सकता है।
  3. सोल्डर जम्पर तार और घटक (पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3)।
    1. जम्पर तारों (इंसुलेटेड वायरिंग जो सर्किट बोर्ड पर दो बिंदुओं को जोड़ती है) के लिए, जम्पर किट से नारंगी [7.6 मिमी (0.3 इंच)] और पीले [12 मिमी (0.4 इंच)] तारों के दो टुकड़ों का उपयोग करें।
    2. पीसीबी बोर्ड को "सहायक हाथों" पर क्लिप करें और निम्नलिखित पिनहोल में जम्पर तार डालें, टर्मिनलों को 45 डिग्री मोड़ें और फ्लक्स जोड़ें (चित्रा 2, पूरक चित्र 2 और पूरक चित्र 3): ए 1 और ए 3 → जमीन (-) (नारंगी), ए 7 → बिजली की आपूर्ति (+) # 7 (पीला), डी 2 → डी 6 (पीला)।
    3. सोल्डर और फिर तारों के पिछले हिस्से को ट्रिम करें।
    4. निम्नलिखित पिनहोल में एलएम 317 टी वोल्टेज नियामक डालें, पिन को मोड़ें, और फ्लक्स जोड़ें (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 4): adj → e5, V→ e6, V → e7में ।
    5. पहले बाएं और दाएं टर्मिनलों को सोल्डर करें, उन्हें ट्रिम करें, फिर सोल्डर करें और मध्य टर्मिनल को ट्रिम करें।
    6. सर्किट की कम वोल्टेज सीमा सेट करने के लिए, पिनहोल, सोल्डर और ट्रिम सी 2 → सी 5 (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 5) में 820 Ω प्रतिरोधक डालें।
    7. माइक्रोकंट्रोलर द्वारा एलईडी नियंत्रण को सक्षम करने के लिए, ट्रांजिस्टर को बी 3-बी 5 (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 6) में डालें: कलेक्टर → बी 3, बेस → बी 4, एमिटर → बी 5।
      नोट: सही ढंग से सम्मिलित करने के लिए ट्रांजिस्टर के अभिविन्यास से अवगत रहें; कलेक्टर, बेस और एमिटर पदनाम खोजने के लिए स्पेक्स की जांच करें।
  4. पीओटी, एलईडी, माइक्रोकंट्रोलर और पावर स्रोत के लिए वायर-टू-वायर कनेक्टर को सोल्डर करें।
    नोट: तार-से-तार कनेक्टर के तारों के रंग पर ध्यान दें और क्या महिला या पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर का उपयोग कर रहे हैं।
    1. निर्धारित करें कि वांछित एलईडी (चित्रा 1 सी) के लिए "कम वोल्टेज" सर्किट या "उच्च वोल्टेज" सर्किट की आवश्यकता है या नहीं।
      नोट: यदि एलईडी "कम वोल्टेज" सूची में है, तो पीओटी के समानांतर एक प्रतिरोधक की आवश्यकता होती है।
    2. "कम वोल्टेज" या "उच्च वोल्टेज" सर्किट के लिए, तार को छेद ए 5 (पूरक चित्र 7) के माध्यम से एक महिला तार-से-तार कनेक्टर से रखें। कम वोल्टेज सर्किट बनाते समय अभी तक सोल्डर न करें।
      नोट: नंगे तार के सिरों को मोड़ें ताकि छोटे तार के बाल बाहर न निकलें। यदि तार बिना छिद्र के पिनहोल के माध्यम से धक्का देने के लिए बहुत मोटा लगता है, तो 2-6 किस्में काट लें और फिर उन्हें वापस एक साथ मोड़ दें (पूरक चित्र 7 बी-डी)।
    3. "उच्च वोल्टेज" सर्किट बनाते समय, चरण 1.4.5 पर जाएं। "कम वोल्टेज" सर्किट बनाते समय, एक ही छेद (ए 5) के माध्यम से 560° प्रतिरोधक को धक्का दें और तार-से-तार कनेक्टर लीड के साथ सोल्डर करें।
    4. प्रतिरोधक के दूसरे छोर को जमीन से कनेक्ट करें (पूरक चित्र 7 जी)।
    5. मादा वायर-टू-वायर कनेक्टर के दूसरे छोर को जमीन से जोड़ने वाले ए 5 छेद में डालें और इसे सोल्डर करें (पूरक चित्र 8 ए, बी)।
    6. माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन के लिए, एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के एक छोर को छेद ए 4 में डालें और दूसरे को जमीन से जुड़े छेद में डालें (पूरक चित्र 9 ए-सी)।
    7. एलईडी कनेक्शन के लिए, एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर के एक छोर को छेद ए 2 में डालें और दूसरे छोर को जमीन से जुड़े छेद में डालें (पूरक चित्र 9 डी, ई)।

2. बिजली की आपूर्ति, मैनुअल पावर स्विच, पीओटी और माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन का निर्माण करें

  1. बिजली की आपूर्ति का निर्माण करें।
    1. सोल्डर एक नारंगी [7.6 मिमी (0.3 इंच)] जम्पर ए 29 से जमीन पर (पूरक चित्र 10)।
    2. सोल्डर ए 30 से बिजली आपूर्ति (+) तक एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर (पूरक चित्रा 11 ए-सी)।
    3. सोल्डर सी 29 से सी 30 तक एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर (पूरक चित्र 11 डी-एफ)।
    4. कनेक्टर को बिजली आपूर्ति कॉर्ड से काटें, तारों को उजागर करें, और उन्हें पट्टी करें (पूरक चित्र 12 ए-सी)।
    5. फ्लक्स पेन (पूरक चित्रा 3 जी) का उपयोग करके सोल्डरिंग से पहले तारों में फ्लक्स जोड़ें।
    6. एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के चारों ओर एक 3.18 मिमी (1/8 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूब और बिजली आपूर्ति तार के ऊपर 4.76 मिमी (3/16 इंच) का मोटा टुकड़ा रखें (पूरक चित्र 12 डी)।
    7. बिजली की आपूर्ति से तारों और पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर को एक साथ मोड़ें और सोल्डर (पूरक चित्र 12 ई, 13 ए, बी)।
    8. कनेक्शन के ऊपर छोटे व्यास सिकुड़ ट्यूब 3.18 मिमी (1/8 इंच) रखें और उन्हें हीट गन (पूरक चित्र 13 सी, डी) के साथ सिकोड़ें।
    9. छोटी सिकुड़ ट्यूब 3.18 मिमी (1/8 इंच) के ऊपर एक बड़ा व्यास सिकुड़ ट्यूब 4.76 मिमी (3/16 इंच) रखें और फिर से गर्म करें (पूरक चित्र 13 ई, एफ)।
  2. मैन्युअल पावर स्विच बनाएँ।
    1. स्विच के लिए तारों के ऊपर सिकुड़ने वाली ट्यूब 3.18 मिमी (1/8 इंच) रखें (पूरक चित्र 14 ए)।
    2. एक पुरुष तार-से-तार कनेक्टर के तारों को मोड़ें और सोल्डर करें (पूरक चित्र 14 बी, सी)।
    3. सिकुड़ने वाली ट्यूब को सोल्डर सेक्शन पर 3.18 मिमी (1/8 इंच) रखें और हीट गन (पूरक चित्र 14 डी, ई) के साथ सिकुड़ें।
  3. पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर को पीओटी से कनेक्ट करें।
    1. पीओटी के मध्य टर्मिनल के चारों ओर वायर-टू-वायर कनेक्टर के काले तार को लूप करें (पूरक चित्र 15 बी)।
    2. टर्मिनल के चारों ओर कसकर लूप किए गए तार को मोड़ें और इसे सोल्डर करें (पूरक चित्र 15 सी)।
      नोट: छोटे परिशुद्धता प्लायर्स एक तंग मोड़ बनाने में सहायता कर सकते हैं।
    3. टर्मिनल के लिए लाल तार कनेक्शन के साथ दोहराएं, जैसा कि पूरक चित्र 15 डी में है।
    4. लाल तीर के पास धातु टैब को तोड़ने के लिए प्लियर्स का उपयोग करें (पूरक चित्र 15 ई, एफ)।
  4. माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन बनाएं (केवल कंप्यूटर-नियंत्रित एलईडी के लिए आवश्यक)।
    1. यदि एक से अधिक एलईडी के लिए एलईडी ड्राइवर बना रहे हैं, तो एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर (पूरक चित्र 16 ए) को छोड़कर सभी से काले तारों को काट दें।
    2. जैसा कि दिखाया गया है ( पूरक चित्र 16 बी-डी) वायर-टू-वायर कनेक्टर्स के सिरों को छोटा करें।
    3. आयताकार कनेक्टर (पूरक चित्र 16 ई) के माध्यम से घुमावदार सिरों को धक्का दें।

3. एलईडी का निर्माण

  1. तार के सिरों (~ 5 मिमी) को पट्टी करें और पूरक चित्रा 3 जी के रूप में फ्लक्स पेन का उपयोग करके फ्लक्स लागू करें।
    नोट: एलईडी बेस पर तारों को कुशलतापूर्वक सोल्डर करने के लिए, एलईडी बेस और तारों पर संपर्कों में फ्लक्स जोड़ा जाना चाहिए।
  2. तार को नीचे से गर्म करके और ऊपर से सोल्डर जोड़कर तार को टिन दें (पूरक चित्र 17बी)।
  3. फ्लक्स को एलईडी बेस (पूरक चित्रा 17 सी) के सतह संपर्क पर रखने के लिए फ्लक्स पेन का उपयोग करें।
  4. एक बड़ी सोल्डरिंग टिप (~ 4-5 मिमी) (पूरक चित्र 17 डी) पर सोल्डर की एक उदार मात्रा रखें, संपर्क में एलईडी बेस को गर्म करने के लिए इसका उपयोग करें (पूरक चित्र 17 ई)। कुछ सेकंड के बाद, सोल्डर को संपर्क में खींचें (पूरक चित्र 17 एफ)। अन्य संपर्क पर चरण 3.3-3.4 दोहराएं (पूरक चित्र 17 जी)।
    सावधानी: सोल्डरिंग के दौरान एलईडी बेस बहुत गर्म हो सकता है। एलईडी बेस को ऐसी सतह पर रखें जो पिघलेगी या जलेगी नहीं।
  5. हेयर क्लिप (पूरक चित्र 18 ए) का उपयोग करके संपर्क "सी +" (कैथोड) पर काले तार को क्लिप करें।
  6. बड़े सोल्डरिंग टिप (पूरक चित्र 18 बी) पर सोल्डर की एक उदार मात्रा रखें और इसे तार पर तब तक दबाएं जब तक कि एलईडी बेस पर सोल्डर पिघल न जाए (पूरक चित्र 18 सी)। तार को पकड़ो (पूरक चित्र 18 डी) और तार को जगह में रखते हुए सोल्डरिंग लोहे को हटा दें (पूरक चित्र 18 ई)।
  7. एलईडी कनेक्शन (पूरक चित्र 19 ए, बी) के लिए पैड पर सोल्डर पेस्ट की एक छोटी मात्रा रखें और एलईडी को फोर्सप्स (पूरक चित्रा 19 सी) का उपयोग करके पैड पर रखें।
    नोट: यदि प्लेसमेंट थोड़ा बंद है, तो यह ठीक है; सोल्डर पेस्ट पिघलने के बाद यह जगह पर चला जाएगा।
  8. लाल तार को "ए +" (एनोड) पर रखें और इसे बाल क्लिप (पूरक चित्र 20 ए-सी) के साथ क्लिप करें।
  9. बड़ी सोल्डरिंग टिप (पूरक चित्र 20 डी) पर सोल्डर की एक उदार मात्रा रखें और इसे तार पर तब तक दबाएं जब तक कि एलईडी बेस पर सोल्डर और एलईडी के नीचे सोल्डर पेस्ट पिघल न जाए (पूरक चित्र 20 ई)।
    नोट: सोल्डर पेस्ट पिघलने के बाद, रंग चांदी हो जाता है (पूरक चित्र 20 एच, आई)।
  10. वांछित सेट अप के लिए आवश्यक तार की लंबाई चुनें। एलईडी तारों को पट्टी करें, और एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर (पूरक चित्रा 21 ए) फिर पूरक चित्रा 3 जी में फ्लक्स जोड़ें।
  11. सिकुड़ने वाली ट्यूब को तारों के ऊपर रखें। तार-से-तार कनेक्टर्स पर 3.18 मिमी (1/8 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूब और तार के ऊपर 4.76 मिमी (3/16 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूब का उपयोग करें (पूरक चित्र 21 बी)।
  12. वायर-टू-वायर कनेक्टर को "सहायक हाथों" के साथ क्लिप करें और कनेक्टर के अंत को तार (पूरक चित्र 21 सी) के साथ मोड़ें और उन्हें सोल्डर करें। अन्य तार के साथ दोहराएं (पूरक चित्र 21 डी, ई)।
  13. सोल्डर के ऊपर 3.18 मिमी (1/8 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूबों को रखें और सिकुड़ें (पूरक चित्र 21 एफ-जी)।
  14. 4.76 मिमी (3/16 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूब को 3.18 मिमी (1/8 इंच) सिकुड़ने वाली ट्यूब पर रखें और सिकुड़ें (पूरक चित्र 21 एच-1)।
  15. एलईडी तारों को इसके नीचे टेप के साथ "सहायक हाथों" को क्लिप करें (पूरक चित्र 22 ए)।
  16. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपॉक्सी मिलाएं और सोल्डर्ड एलईडी (पूरक चित्रा 22 बी) के शीर्ष पर फैल जाएं। इलाज के लिए रात भर छोड़ दें।
  17. यदि टच फास्टनर का उपयोग करके बढ़ते हैं, तो टच फास्टनर (पूरक चित्रा 23 ए) का एक छोटा टुकड़ा काटें और इसे 30 सेकंड के लिए एलईडी के पीछे दबाएं।
  18. ब्लैक बॉक्स के ढक्कन पर एक पायदान बनाने के लिए एक उच्च गति रोटरी उपकरण का उपयोग करें (पूरक चित्र 23 सी-ई)।
  19. गोपनीयता फिल्म के माध्यम से एकल एलईडी के लिए एक माउंटिंग बनाएं।
    1. कुदाल ड्रिल बिट का उपयोग करके, एक ब्लैक बॉक्स के शीर्ष के माध्यम से 1.75 सेमी (11/16 इंच) छेद ड्रिल करें जहां एलईडी रखा जाएगा (पूरक चित्र 24 ए)।
    2. एक उच्च गति रोटरी उपकरण का उपयोग करके, एलईडी तार के लिए जगह बनाने के लिए छेद के एक तरफ एक पायदान बनाएं, जैसा कि पूरक चित्र 24 ए में दिखाया गया है।
    3. गोपनीयता फिल्म (25-30 मिमी) का एक टुकड़ा काटें और छेद को कवर करने वाले ब्लैक बॉक्स के अंदर टेप करें जिसे एलईडी के माध्यम से रोशन किया जाएगा (पूरक चित्र 24 ए)।
    4. एलईडी को ब्लैक बॉक्स के बाहर छेद के शीर्ष पर गोपनीयता फिल्म और टेप के साथ विद्युत टेप (पूरक चित्र 24 बी-ई) के साथ रखें।

4. रोशनी प्रणाली को फिट करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स को समायोजित करें

  1. चार एलईडी सिस्टम के लिए, ढक्कन पर 3.81 सेमी (1.5 इंच) के चार 0.83 सेमी (21/64 इंच) छेद ड्रिल करें जहां पोटेंशियोमीटर संलग्न होंगे (पूरक चित्र 25)।
  2. एक उच्च गति रोटरी उपकरण का उपयोग करके, शीर्ष-बाएं कोने में 1.19 सेमी x 1.90 सेमी (0.47 इंच x 0.75 इंच) आयताकार छेद काटें (पूरक चित्र 25)।
  3. कुदाल ड्रिल बिट का उपयोग करके, ब्लैक बॉक्स पर 1.75 सेमी (11/16 इंच) छेद ड्रिल करें (पूरक चित्र 26)।
  4. छेद ों को फ़ाइल करें और ग्रिमेट को ड्रिल किए गए छेद में डालें (पूरक चित्र 26)।
  5. कंप्यूटर-नियंत्रित एलईडी के लिए, सैंडपेपर वह क्षेत्र जहां माइक्रोकंट्रोलर को एक ब्लैक बॉक्स में चिपकाया जाएगा, साथ ही माइक्रोकंट्रोलर धारक के निचले हिस्से को भी।
  6. ब्लैक बॉक्स में धारक को सुरक्षित करने से पहले धारक पर माइक्रोकंट्रोलर स्नैप करें और फिर उन्हें जगह पर एपॉक्सी करें (पूरक चित्र 27 ए)।
  7. दो क्लिप के निचले हिस्से और एक ब्लैक बॉक्स में क्षेत्र जहां सर्किट रखा जाएगा, सैंडपेपर का उपयोग करें और एपॉक्सी (पूरक चित्रा 27 ए) के साथ ब्लैक बॉक्स के अंदर क्लिप को सुरक्षित करें।
  8. पीसीबी बोर्ड को क्लिप में सुरक्षित करें (पूरक चित्रा 27 बी)।
  9. पूरक चित्र 25 में बनाए गए ढक्कन में चौकोर छेद के माध्यम से पावर स्विच को धक्का दें और इसे जगह पर स्नैप करें (पूरक चित्र 28 ए)।
  10. ढक्कन पर छेद के माध्यम से पीओपीटी को धक्का दें, जगह में पेंच (पूरक चित्र 28 ए), और नॉब को पीओटी (पूरक चित्र 28 बी) पर रखें।

5. सभी तारों और उपकरणों को कनेक्ट करें

  1. वायर-टू-वायर कनेक्टर्स (जैसे, एलईडी, पॉट, सीओएम) को लेबल करें (पूरक चित्रा 29 ए)।
  2. चरण 2.4 (पूरक चित्र 16) में किए गए क्रैम्प्ड कनेक्टर को दो महिला कनेक्टर (पीओटी और एलईडी) (पूरक आंकड़े 7 ए और एस 37) के बीच पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर से संलग्न करें।
  3. संकुचित सिरों को माइक्रोकंट्रोलर (पूरक चित्र 30) में कनेक्ट करें।
  4. ग्रोममेट के माध्यम से यूएसबी केबल खींचें और इसे माइक्रोकंट्रोलर में प्लग करें।
  5. ग्रोममेट के माध्यम से एलईडी के लिए तारों को खींचें और माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन (पूरक आंकड़े 9 डी और 38) के बाईं ओर महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर से कनेक्ट करें।
  6. ग्रोममेट के माध्यम से बिजली की आपूर्ति के लिए तार खींचें और इसे पीसीबी बोर्ड के दाईं ओर पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर से कनेक्ट करें (पूरक चित्र 11 डी)।
  7. पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर को पावर स्विच से पीसीबी बोर्ड के दाईं ओर महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर से कनेक्ट करें (पूरक चित्र 11 ए)।
  8. ढक्कन पर पीओपीटी से पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर्स को पीसीबी बोर्ड पर महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर्स से कनेक्ट करें (पूरक आंकड़े 8 और 36)।
    नोट: पोटेंशियोमीटर कनेक्ट किए बिना सर्किट को चालू न करें।

6. एलईडी नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्थापित करें

नोट: Github पर पूरक फ़ाइल में विस्तृत सॉफ़्टवेयर स्थापना निर्देश देखें। https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामिंग के लिए सॉफ़्टवेयर डाउनलोड और स्थापित करें
  2. पैकेज प्रबंधक डाउनलोड और स्थापित करें।
  3. माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्राम करें।
  4. डाउनलोड करें और रनटाइम इंजन स्थापित करें।
  5. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस डाउनलोड करें।

7. प्रकाश के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें

  1. ट्रांसक्रिप्ट एचईके 293 कोशिकाएं।
    1. प्लेट एचईके 293 कोशिकाएं 24-वेल प्लेट में प्रति कुएं 100k कोशिकाओं पर होती हैं।
    2. सीरम-मुक्त मीडिया, पॉलीथाइलेनिमाइन (पीईआई), और डीएनए वॉल्यूम (पूरक चित्रा 39) की गणना करने के लिए उदाहरण तालिका का उपयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थानांतरित करें।
  2. प्रकाश के साथ उत्तेजक कोशिकाएं।
    नोट: कोशिकाओं को अभिकर्मक के बाद अंधेरे में रखा जाना चाहिए या एक प्रकाश स्रोत का उपयोग करके संभाला जाना चाहिए जो ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को उत्तेजित नहीं करता है।
    1. तय करें कि कोशिकाओं पर किस प्रकार की उत्तेजना का उपयोग किया जाएगा (निरंतर प्रकाश, स्पंदन तीव्रता, आदि)।
    2. पीओपी बंद होने के साथ (काउंटरक्लॉकवाइज), एलईडी बिजली की आपूर्ति चालू करें।
    3. ब्लैक बॉक्स के अंदर एक हल्का मीटर रखें जहां कोशिकाओं को रखा जाएगा और मीटर के ऊपर एलईडी के साथ ढक्कन रखें। आवश्यकतानुसार प्रकाश तीव्रता समायोजित करें।
    4. यदि एलईडी को नियंत्रित करने के लिए कंप्यूटर का उपयोग कर रहे हैं, तो उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस सॉफ़्टवेयर खोलें।
    5. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रोग्राम करें (चित्रा 5ए, बी)।
      1. शीर्ष बाएं पैनल पर, माइक्रोकंट्रोलर के लिए COM पोर्ट का चयन करें और कनेक्ट पर क्लिक करें।
      2. प्रत्येक एलईडी को प्रोग्राम करने के लिए दाईं ओर पैनलों का उपयोग करें। निरंतर प्रकाश के लिए, "टाइम ऑन" में शून्य को छोड़कर किसी भी समय का चयन करें और "टाइम ऑफ" को शून्य पर सेट करें।
      3. निचले दाएं पैनल पर, मुख्य समय नियंत्रण प्रोग्राम करें।
        1. रोशनी में देरी करने के लिए, एक प्रारंभ देरी (HH: MM) का चयन करें।
        2. निर्दिष्ट समय के बाद सभी एलईडी को बंद करने के लिए, एक रन टाइम (HH:MM) का चयन करें।
        3. रन बटन (चित्रा 5 ए) पर क्लिक करके रोशनी कार्यक्रम शुरू करें।

8. दोहरी लूसिफेरस परख का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को मापें

  1. 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए 1 एमएल ट्यूबों में ल्यूसिफेरस अभिकर्मक और एलिकोट के साथ 10 एमएल ल्यूसिफेरस बफर को मिलाकर ल्यूसिफेरस अभिकर्मक तैयार करें।
  2. एन + 2 कुओं के लिए 100 μL के लिए लाइसिस बफर 5x को 1x में तैयार करें। उदाहरण के लिए, 30 नमूनों के लिए, 5एक्स लाइसिस बफर के 30 x 20 μL, और MQ H2O के 30 x 80 μL।
  3. रेनिला सब्सट्रेट समाधान तैयार करें: रेनिला बफर के 1 एमएल के लिए रेनिला सब्सट्रेट का 20 μL (यह राशि 10 परखों के लिए उपयुक्त है)।
  4. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें, मीडिया को उत्तेजित करें, प्रति अच्छी तरह से 100 μL 1x लाइसिस बफर जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर शेकर पर रखें।
  5. कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  6. एक सफेद 96-वेल प्लेट के कुएं में प्रति नमूना 100 μL ल्यूसिफेरस अभिकर्मक जोड़ें।
  7. ल्यूमिनेसेंस के लिए प्लेट रीडर सेट करें। प्लेट रीडर के लुमिनोमीटर मॉड्यूल का उपयोग करके, 1 एस के लिए एकीकरण सेट करें।
  8. ल्यूसिफेरस अभिकर्मक के नीचे कुओं में पिघले हुए लाइसेट जोड़ें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, ल्यूसिफेरस अभिकर्मक में 20 μL नमूना मिलाएं और तुरंत ल्यूमिनेसेंस को मापें।
  9. रीडिंग पठार के बाद, रेनिला सब्सट्रेट समाधान के 100 μL जोड़ें और फिर से स्कैन करें।
  10. अभिकर्मक दक्षता के लिए रेनिला सिग्नल द्वारा लूसिफेरस सिग्नल को विभाजित करें।
  11. अभिकर्मक दक्षता के लिए सामान्यीकृत ल्यूसिफेरस संकेतों की तुलना करें (उदाहरण के लिए, लाल बत्ती रोशन और दूर-लाल प्रकाश रोशन नमूनों से संकेत की तुलना करें)।

Representative Results

एक बार पावर सर्किट, पावर सप्लाई, पावर स्विच, पीओपीटी और एक एलईडी इकट्ठी हो जाने के बाद ( पूरक चित्र 21 तक), सर्किट का परीक्षण किया जा सकता है। सभी पीओपीटी के साथ, पीओटी एलईडी तीव्रता को नियंत्रित करेगा। एक बार पूरक चित्र 29 तक असेंबली पूरी हो जाने के बाद, सिस्टम का उपयोग ऑप्टोजेनेटिक्स या अन्य अनुप्रयोगों के लिए मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। पूरे सिस्टम पावर को पावर स्विच के साथ मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। प्रत्येक एलईडी की तीव्रता को प्रत्येक सर्किट से जुड़े पीओटी का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है।

सॉफ्टवेयर स्थापित करने और माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामिंग करने के बाद, उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस माइक्रोकंट्रोलर के साथ संवाद कर सकता है। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ, एलईडी को कई तरीकों से अस्थायी रूप से नियंत्रित किया जा सकता है: (1) प्रत्येक एलईडी को एक निर्दिष्ट समय तक रहने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, (2) प्रत्येक एलईडी को पल्स करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, (3) एक वैश्विक शुरुआत देरी (उदाहरण के लिए, 24 घंटे बाद प्रकाश को स्थानांतरित और चमकते समय) प्रोग्राम किया जा सकता है (चित्रा 6 बी), (4) देरी के बाद प्रोग्राम चलाने का कुल समय। दो उपयोगकर्ता इंटरफेस हैं, एक बड़े बटन के साथ जो एक समय में दो एलईडी को नियंत्रित कर सकता है और दूसरा जो चार एलईडी को नियंत्रित कर सकता है (चित्रा 5ए, बी)। दो एलईडी यूजर इंटरफेस टैबलेट के लिए अनुकूलित है और कई प्रयोगों के लिए लाल और दूर-लाल एलईडी को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त है।

बड़े प्रयोगों के लिए, दूसरे उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग चार एलईडी तक नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करते समय, प्रत्याशित परिणाम कई मापदंडों पर निर्भर करता है। इनमें प्रेरण समय, प्रेरण स्तर (जैसे, प्रकाश या दवा की मात्रा), और सेल में इंड्यूसेबल निर्माण की प्रतिलिपि संख्या शामिल है। इसे दिखाने के लिए, हमने रिपोर्टर डीएनए (पीपीके -202) (0.5%, 1%, 2%, 4%, और 8% ट्रांसक्रिप्टेड डीएनए) (चित्रा 6 ए) की विभिन्न मात्रा के साथ फीबी जीन स्विच को स्थानांतरित किया और चित्र 6 बी में दिखाए गए अनुसार रोशन किया। फाइब युक्त नमूनों में, लेकिन फाइकोसायनोबिलिन (पीसीबी-क्रोमोफोर) (यानी, प्रकाश के प्रति अनुत्तरदायी) का उत्पादन करने के लिए कोई प्लास्मिड नहीं है, ल्यूसिफेरस जीन अभिव्यक्ति / रिसाव रिपोर्टर डीएनए (चित्रा 6 सी) (दूर-लाल पी < 0.0001, वाल्ड परीक्षण के बाद रैखिक प्रतिगमन) की मात्रा के साथ बढ़ता है, (रेड पी < 0.0001, रैखिक प्रतिगमन के बाद वाल्ड परीक्षण)। इसके अलावा, जब पीसीबी-क्रोमोफोर उत्पादक प्लास्मिड (प्रकाश-संवेदनशील कोशिकाओं) सहित पूरे फीबी जीन स्विच को दूर-लाल प्रकाश के लिए रोशन किया जाता है, तो ल्यूसिफेरस अभिव्यक्ति भी अभिकर्मक मिश्रण (चित्रा 6सी, डी) (दूर-लाल प्रकाश पी < 0.0001, रैखिक प्रतिगमन के बाद वाल्ड परीक्षण) में बढ़ती रिपोर्टर निर्माण मात्रा के साथ बढ़ जाती है। इसी तरह, जब प्रकाश-संवेदनशील कोशिकाओं को लाल रोशनी से रोशन किया जाता है, तो लूसिफेरस अभिव्यक्ति भी रिपोर्टर मात्रा में वृद्धि के साथ बढ़ जाती है (पी < 0.0001, रैखिक प्रतिगमन के बाद वाल्ड परीक्षण)। जब लाल प्रकाश उपचारित कोशिकाओं के प्रेरण स्तर की तुलना दूर-लाल प्रकाश उपचारित कोशिकाओं से की जाती है, तो हमने रिपोर्टर की मात्रा (चित्रा 6 ई) (पी = 0.0141, रैखिक प्रतिगमन के बाद वाल्ड परीक्षण) के साथ फोल्ड सक्रियण में थोड़ी कमी पाई।

Figure 1
चित्रा 1: एक एलईडी के लिए एक बुनियादी सर्किट। (ए) एक प्रवाह चार्ट जो एलईडी रोशनी प्रणाली के निर्माण के लिए आवश्यक चरणों का अवलोकन दिखाता है। (बी) एलईडी रोशनी नियंत्रण प्रणाली। (बाएं) एलईडी तीव्रता और समय को विनियमित करने के लिए नियंत्रण बॉक्स। (मध्य) एलईडी को नियंत्रित करने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस चलाने वाला एक पीसी टैबलेट। (दाएं) एलईडी को बढ़ाने और ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए कोशिकाओं को रखने के लिए एक ब्लैक बॉक्स। (ग) यह निर्धारित करने के लिए तालिका कि एलईडी को उच्च वोल्टेज परिपथ की आवश्यकता है या नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: घटकों को जगह में सोल्डर करने के लिए निर्देश। (ए) सर्किट के निर्माण के लिए चरण-दर-चरण कार्टून निर्देशों का एक उदाहरण। (बी, सी) डिवाइस को इकट्ठा किए जाने के चित्रों के साथ उदाहरण निर्देश. (डी) एक साथ कई सर्किटों को इकट्ठा करने के लिए उदाहरण निर्देश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक इकट्ठे एलईडी नियंत्रण प्रणाली के दृश्य। (ए) इकट्ठे सिस्टम का एक शीर्ष बाहरी दृश्य। (बी) इकट्ठे चार एलईडी रोशनी प्रणाली का एक आंतरिक दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: गर्मी सिंक पर एलईडी को फिर से प्रवाहित करने के निर्देश। (ए) एलईडी बेस और एक गहरे लाल एलईडी का बंद होना। (बी) एलईडी बेस पर सोल्डर पेस्ट का प्लेसमेंट। (सी) सोल्डर्ड एलईडी का चित्र। लाल तीर सोल्डरिंग पैड की ओर इशारा करते हैं। सोल्डरिंग (ए) से पहले ग्रे की तुलना में, सोल्डरिंग के बाद, सोल्डर धातु / चमकदार दिखाई देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर। (ए) एक सस्ती टैबलेट के साथ आसान उपयोग के लिए बड़े बटन के साथ एक दो एलईडी यूजर इंटरफेस। (बी) एक चार एलईडी यूजर इंटरफेस। दोनों इंटरफेस स्वतंत्र एलईडी नियंत्रण की अनुमति देते हैं। स्पंदन के लिए, एलईडी को विशिष्ट पल्स चौड़ाई और निर्दिष्ट अवधि के लिए चालू और बंद करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। स्पंदन में शुरुआत में देरी और पूर्व निर्धारित कुल रन टाइम भी हो सकता है। (सी) एलईडी कंट्रोल टैबलेट एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर पर लगाया गया है। (डी) दूर-लाल रोशनी से रोशन होने पर फाइब जीन प्रणाली का चित्रण। दूर-लाल प्रकाश जीन को "बंद" या "अंधेरे" स्थिति में रखता है। (ई) लाल रोशनी से रोशन होने पर फाइब जीन प्रणाली का चित्रण। लाल प्रकाश PhyB और PIF3 के बीच बातचीत को बढ़ावा देकर जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। यह इंटरैक्शन पीआईएफ 3 से जुड़े जीन सक्रियण डोमेन (एडी) को यूएएस प्रमोटर से जोड़ता है, जिससे रिपोर्टर जीन सक्रिय होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: PhyB को नियंत्रित करने के लिए एलईडी सिस्टम का उपयोग करके प्रत्याशित परिणाम। (ए) एक प्लास्मिड एन्कोडिंग फाइबी + पीआईएफ 3 दो-हाइब्रिड पार्टनर्स (पीपीके -351), एक प्लास्मिड एन्कोडिंग फाइकोसायनोबिलिन (पीसीबी-क्रोमोफोर) संश्लेषण एंजाइम (पीपीके -352), और एक लुसिफेरस रिपोर्टर प्लास्मिड (पीपीके -202)। (बी) रिपोर्टर डीएनए की बढ़ती मात्रा के साथ सी-ई के लिए प्रकाश प्रेरण प्रयोगों की समयरेखा (सी) बेसल ट्रांसक्रिप्शन स्तर (एकेए रिसाव)। "लीक" नमूने पीपीके -352 (यानी, प्रकाश के प्रति अनुत्तरदायी) के साथ स्थानांतरित नहीं होते हैं, लेकिन लाल या दूर-लाल रोशनी से रोशन होते हैं। लाइट स्विच (एलएस) नमूनों में सभी लाइट-जीन स्विच प्लास्मिड शामिल हैं और लाल या दूर-लाल रोशनी से रोशन होते हैं। (डी) लाल और दूर-लाल प्रकाश के जवाब में प्रकाश प्रेरण स्तर। (एलएस-फार-रेड लाइट सी और डी में समान डेटा है। (ई) लाल प्रकाश/दूर-लाल प्रकाश से रोशन कोशिकाओं में लूसिफेरस का फोल्ड प्रेरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

 पूरक आंकड़े 1-39 डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: कई एलईडी के लिए इलेक्ट्रॉनिक ड्राइवर सर्किट। (ए) एकल एलईडी प्रणाली के लिए सर्किट आरेख। (बी) चार एलईडी प्रणाली के लिए सर्किट आरेख।

पूरक चित्र 2: सर्किट इंटरकनेक्शन रखना। (ए) अपने पीसीबी बोर्ड को अपने मदद के हाथों पर क्लिप करें। (बी) चित्र में छेद के माध्यम से मुख्य सर्किट जम्पर्स की स्थिति। (सी) निर्देशांक का मानचित्रण करने वाले तार कनेक्टर का आरेख। चार एलईडी प्रणालियों के लिए, दिखाए गए अनुसार प्रत्येक सर्किट को विभाजित करने वाली रेखाएं खींचें (काली ऊर्ध्वाधर रेखाएं)। पूरक चित्र 31-38 एक साथ चार सर्किटों की विधानसभा का वर्णन करता है।

पूरक चित्र 3: पीसीबी पर तारों को सोल्डर करना। (ए) बेंड जंपर्स ताकि वे पीसीबी के साथ सीधा संपर्क करें और सोल्डरिंग करते समय जगह पर रहें। (बी) मुड़े हुए तारों का एक और दृश्य। (ग) सोल्डरिंग के बाद तार। (डी) पीसीबी पर तारों की छंटनी। (ई) सोल्डर के साथ गर्म करने के बाद सिकुड़ा हुआ इन्सुलेशन। (एफ) इन्सुलेशन को जमीन को कवर करने के लिए स्थिति में ले जाना (नीला तीर) (जी) तार के अंत या टर्मिनल में फ्लक्स जोड़ना।

पूरक चित्र 4: वोल्टेज नियामक को जगह में बदलना। (ए) वोल्टेज नियामक निर्देशांक का नक्शा। (बी) वोल्टेज नियामक की नियुक्ति। (सी) बेंट वोल्टेज नियामक लीड करता है। (डी) सोल्डरिंग के बाद वोल्टेज नियामक टर्मिनल।

पूरक चित्र 5: आर 1 प्रतिरोधक को जगह में बदलना। (ए) आर 1 प्रतिरोधक (820) निर्देशांक का नक्शा। (बी) प्लियर्स का उपयोग करके लीड द्वारा प्रतिरोधक को खींचना (सी) खींचे गए प्रतिरोधक को पीसीबी के करीब ले जाया जाता है। (डी) पीसीबी के करीब सोल्डरेड रेसिस्टर।

पूरक चित्र 6: ट्रांजिस्टर को जगह में सोल्ड करना। (ए) ट्रांजिस्टर निर्देशांक और अभिविन्यास का नक्शा। (बी) ट्रांजिस्टर के अभिविन्यास पर ध्यान दें; इस मॉडल में लेबल वोल्टेज नियामक (एलएम 317 टी) का सामना कर रहा है। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्रांजिस्टर के विनिर्देश को फिर से जांचें कि "एमिटर", "बेस" और "कलेक्टर" सही छेद में हैं। (सी) सोल्डरिंग से पहले मुड़े हुए टर्मिनलों के साथ ट्रांजिस्टर।

पूरक चित्र 7: पोटेंशियोमीटर के लिए वायर-टू-वायर कनेक्टर को जगह में बदलना (साथ ही कम वोल्टेज सर्किट के लिए 560° प्रतिरोधक)। (ए) वायर-टू-वायर कनेक्टर के निर्देशांक का नक्शा (साथ ही आर 3-560 यदि कम वोल्टेज सर्किट का निर्माण करता है, तो वायर-टू-वायर कनेक्टर को प्रतिरोधक से पहले छेद में रखा जाता है)। (बी) एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर। (सी) प्रतिरोधक और तार-से-तार कनेक्टर को थ्रू-होल में फिट करने की सुविधा के लिए, चोटी वाले तार के 3-5 किस्में मुड़ी हुई हैं। (डी) तारों को तार कटर से काट दिया जाता है जितना संभव हो इन्सुलेशन के करीब। (ई) छेद के माध्यम से ए 5 के माध्यम से एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर का लाल तार डाला गया (कम वोल्टेज सर्किट के लिए छेद के माध्यम से आर 3 डालें)। (एफ) सोल्डरिंग से पहले प्रतिरोधक और वायर-टू-वायर कनेक्टर का अंडरसाइड व्यू। (G) जमीन से जुड़े सोल्डर्ड आर 3 प्रतिरोधक की छवि (एफ = महिला)।

पूरक चित्र 8: पोटेंशियोमीटर के लिए तार-से-तार कनेक्टर को जमीन पर सोल्ड करना। (ए) पोटेंशियोमीटर वायर-टू-वायर कनेक्टर के लिए ग्राउंड कनेक्शन के निर्देशांक का नक्शा। (बी) आर 3 (एफ = महिला) के समानांतर पोटेंशियोमीटर वायर-टू-वायर कनेक्टर का शीर्ष दृश्य।

पूरक चित्रा 9: माइक्रोकंट्रोलर और एलईडी वायर-टू-वायर कनेक्टर को सोल्डर करना। (ए) 2एन 222 ए और जमीन को माइक्रोकंट्रोलर से जोड़ने के लिए वायर-टू-वायर कनेक्टर के निर्देशांक का नक्शा। (बी) सोल्डरेड नर वायर-टू-वायर कनेक्टर। (ग) (बी) का शीर्ष दृश्य। (डी) सर्किट और ग्राउंड के इनपुट को एलईडी से जोड़ने के लिए महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर निर्देशांक का नक्शा। (E) सोल्डरेड महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर (F = महिला, M = पुरुष)।

पूरक चित्र 10: बिजली आपूर्ति सर्किट के लिए जम्पर को सोल्डर करना। (ए) बिजली की आपूर्ति को जमीन से जोड़ने के लिए नारंगी जम्पर के निर्देशांक का नक्शा। (बी) नारंगी जम्पर जगह पर सोल्डर। (सी) जम्पर का अंडरसाइड व्यू जगह-जगह बिखरा हुआ था।

पूरक चित्र 11: पावर स्विच और पावर सोर्स वायर-टू-वायर कनेक्टर को सोल्डर करना। (ए) पावर स्विच को जोड़ने के लिए महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर के निर्देशांक का नक्शा। (बी) मादा वायर-टू-वायर कनेक्टर जगह-जगह सोल्डर किया गया। (C) (B) का एक और दृष्टिकोण। (डी) बिजली स्रोत को जोड़ने के लिए पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के निर्देशांक का नक्शा। (ई) सोल्डरेड नर वायर-टू-वायर कनेक्टर। (F) (E) का एक और दृष्टिकोण (F = महिला, M = पुरुष)।

पूरक चित्र 12: बिजली की आपूर्ति को एक पुरुष तार-से-तार कनेक्टर से जोड़ना। (ए) असंशोधित बिजली आपूर्ति। (बी) बिजली आपूर्ति के तारों को काटना। (C) बिजली आपूर्ति के तार छीन लिए गए और अतिरिक्त इन्सुलेशन के साथ काट दिया गया। (घ) विद्युत आपूत तारों के चारों ओर सिकुड़ी हुई ट्यूब लगाना। दो कनेक्शन (लाल तीर) को अलग करने वाली ट्यूबिंग और अलग-अलग तारों (पीले तीर) को पकड़ने के लिए टयूबिंग। (ई) महिला तार-से-तार कनेक्टर को बिजली की आपूर्ति को जोड़ने वाले मुड़े हुए तार।

पूरक चित्र 13: एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के लिए बिजली आपूर्ति कनेक्शन को सोल्डरिंग और इन्सुलेट करना। (ए) बिजली आपूर्ति ग्राउंड और एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर के बीच सोल्डर कनेक्शन। (बी) बिजली आपूर्ति के सकारात्मक टर्मिनल और एक महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर के बीच सोल्डर कनेक्शन। (सी) सिकुड़ने वाली ट्यूब को सोल्डरेड व्यक्तिगत कनेक्शन (लाल तीर) पर खींचा जाता है। (डी) दोनों बिजली आपूर्ति कनेक्शन सोल्डर और गर्मी-उपचारित सिकुड़ ट्यूब के साथ। (ई) अलग-अलग कनेक्शन (पीले तीर) पर सिकुड़ ट्यूब का प्लेसमेंट। (च) पूर्ण विद्युत आपूत।

पूरक चित्र 14: पावर स्विच को पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर में बदलना। (ए) छीने गए तारों के साथ पावर स्विच और तारों (लाल तीर) के ऊपर रखी गई ट्यूब। (बी) स्विच और पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर को जोड़ने वाले तार सोल्डरिंग से पहले एक साथ मुड़ जाते हैं। (सी) सोल्डर कनेक्शन के ऊपर सिकुड़ने वाली ट्यूब रखना। (डी) गर्मी-उपचारित सिकुड़ ट्यूब के साथ कवर किए गए कनेक्शन। (E) एक पावर स्विच जो एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के साथ इकट्ठा होता है।

पूरक चित्र 15: एक पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर के लिए एक पोटेंशियोमीटर को वायर करना। (ए) पोटेंशियोमीटर भाग। (बी) एक नर वायर-टू-वायर कनेक्टर मुड़ा हुआ और पोटेंशियोमीटर के मध्य टर्मिनल के चारों ओर हुक करने के लिए झुका हुआ। (सी) एक नर वायर-टू-वायर कनेक्टर पोटेंशियोमीटर के मध्य टर्मिनल के चारों ओर मुड़ जाता है। (डी) सोल्डरेड वायर-टू-वायर कनेक्शन। (ई) हटाने से पहले धातु टैब की ओर इशारा करने वाला लाल तीर। (एफ) धातु टैब हटाने के बाद शक्तिशाली।

पूरक चित्रा 16: माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन को वायरिंग करना। (ए) मादा वायर-टू-वायर कनेक्टर के तारों को काट दिया जाता है और काट दिया जाता है। (बी) वायर-टू-वायर कनेक्टर पर क्रिम्प का प्लेसमेंट। (सी) वायर-टू-वायर कनेक्टर का पालन करना। (डी) क्रिम्प्ड वायर-टू-वायर कनेक्टर। (ई) पूरी तरह से इकट्ठे माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन।

पूरक चित्र 17: एलईडी बेस भाग 1 पर सोल्डरिंग तार और एलईडी। (ए) एलईडी को एलईडी बेस में बेचने के लिए आवश्यक सामग्री। (बी) छीने गए तार की नोक को टिनकरना। (सी) एलईडी बेस के संपर्क पर फ्लक्स लागू करना। (डी) एलईडी बेस को टिन करने के लिए बड़े सोल्डरिंग टिप में सोल्डर जोड़ना। (ई) एलईडी बेस को गर्म करने के लिए संपर्क पर सोल्डर की नियुक्ति। (एफ) संपर्क में सोल्डरिंग टिप खींचने के बाद एलईडी बेस। (जी) दूसरे संपर्क पर एक ही प्रक्रिया।

पूरक चित्र 18: एलईडी बेस भाग 2 पर सोल्डरिंग तार और एलईडी। (ए) एक टिन वाला तार एक बाल क्लिप का उपयोग करके संपर्क में फिसल गया। ध्यान दें कि काले तार को कैथोड "सी-" से जोड़ा जाता है। (बी) सोल्डरिंग टिप में सोल्डर की एक उदार राशि जोड़ना। (सी) सोल्डरिंग टिप तार पर दबाता है, एलईडी बेस और तार पर सोल्डर को पिघलाता है। (d) तार को नीचे रखें ताकि सोल्डरिंग लोहे को हटाने पर यह रखा जा सके। (E) तार को तब तक रखें जब तक सोल्डर सख्त न हो जाए।

पूरक चित्र 19: एलईडी बेस भाग 3 पर सोल्डरिंग तार और एलईडी। (ए) एलईडी को बढ़ाने के लिए एलईडी बेस पर सोल्डर पेस्ट रखने के लिए एक तेज टिप का उपयोग करना। (बी) सोल्डरिंग पेस्ट के साथ एलईडी बेस। (ग) एलईडी बेस पर एलईडी को इस तरह लगाना कि एलईडी और एलईडी बेस के संपर्क मेल खाते हों।

पूरक चित्र 20: एलईडी बेस भाग 4 पर सोल्डरिंग तार और एलईडी। (ए) काले तार अभी भी बाल क्लिप द्वारा संपर्क में फिसल गए। (बी, सी) एक दूसरे हेयर क्लिप का उपयोग करके, लाल तार को जगह में रखा जाता है। ध्यान दें कि लाल तार एनोड "ए +" से जुड़ा हुआ है। (डी) सोल्डरिंग टिप में सोल्डर की एक उदार राशि जोड़ना। (ई) सोल्डरिंग टिप को तार पर दबाने, एलईडी बेस पर सोल्डर को पिघलाने और तार के साथ-साथ एलईडी के नीचे सोल्डर पेस्ट। (एफ) सोल्डरिंग के बाद गर्म एलईडी बेस कूलिंग। (छ) तारों और एलईडी के साथ एलईडी बेस। (एच, आई) लाल तीर सोल्डरिंग पैड की ओर इशारा करते हैं। सोल्डरिंग के बाद, सोल्डर धातु / चमकदार दिखाई देता है (सोल्डरिंग से पहले ग्रे की तुलना में (पूरक चित्र 16 डी))।

पूरक चित्रा 21: एलईडी तार को पुरुष तार-से-तार कनेक्टर से जोड़ना। (ए) सिकुड़ने वाली ट्यूब के बगल में टूटे हुए तार और नर वायर-टू-वायर कनेक्टर आधे (1/8 इंच और 3/16 इंच) में काटे जाते हैं। (बी) सोल्डरिंग से पहले तारों पर ट्यूब प्लेसमेंट को सिकोड़ें। (C) तारों को सोल्डरिंग से पहले एक साथ मोड़ दिया गया। (डी) तार से तार-से-तार कनेक्टर तक सोल्डर कनेक्शन। (E) लाल और काले दोनों तार एक साथ सोल्डर होते हैं। (एफ) सोल्डर कनेक्शन पर 1/8 इंच सिकुड़ने वाली ट्यूब का प्लेसमेंट। (जी) हीट गन के साथ सिकुड़ने के बाद सिकुड़ने वाली ट्यूब। (एच) छोटी सिकुड़ ट्यूब पर 3/16 इंच सिकुड़ने वाली ट्यूब का प्लेसमेंट। (I) कनेक्शन को सिकुड़ने वाली ट्यूब के साथ जोड़ा और सील किया गया।

पूरक चित्रा 22: एपॉक्सी का उपयोग करके एलईडी बेस पर तारों और एलईडी को सुरक्षित करना। (ए) एलईडी बेस में एपॉक्सी रखने के लिए लकड़ी के एप्लिकेटर का उपयोग करना। किसी भी टपकते एपॉक्सी को पकड़ने के लिए नीचे एक टेप रखा गया है। (बी) एपॉक्सी पूरी सतह पर समान रूप से फैला हुआ है। (सी) एलईडी को इलाज के लिए रात भर छोड़ दिया जाता है।

पूरक चित्र 23: एक बॉक्स ढक्कन के अंदर एलईडी माउंट करना। (ए) आसानी से माउंटिंग के लिए एक टच फास्टनर पीस के साथ एक एलईडी। (बी) टच फास्टनर का उपयोग करके एक ब्लैक बॉक्स के अंदर लगाए गए विभिन्न रंग के एलईडी। (सी) एलईडी तार के लिए जगह बनाने के लिए एक उच्च गति वाले रोटरी उपकरण द्वारा बनाए गए ब्लैक बॉक्स के ढक्कन पर एक नॉच। (डी) एलईडी को बढ़ाने के लिए टच फास्टनर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स। (ई) एलईडी बॉक्स के टच फास्टनर संस्करण के अंदर एक मल्टीवेल डिश का प्लेसमेंट।

पूरक चित्र 24: बॉक्स ढक्कन के बाहर एलईडी लगाना। (ए) तार (लाल तीर) के लिए जगह बनाने के लिए हाई-स्पीड रोटरी टूल से एक पायदान के साथ ब्लैक बॉक्स के ढक्कन में छेद किया गया। (बी) एलईडी को नॉच में तार के साथ छेद में रखा गया, जिसे विद्युत टेप के साथ रखा गया। (सी) एलईडी को सुरक्षित करने के लिए टेप के दो और टुकड़ों का उपयोग किया जाता है। गर्मी सिंक का पिछला हिस्सा गर्मी विनिमय को अधिकतम करने के लिए उजागर होता है। (डी) उस छेद पर गोपनीयता फिल्म टैप की गई जहां एलईडी रखा जाएगा। लाल तीर गोपनीयता फिल्म की ओर इशारा करता है। (ई) बॉक्स के बाहर लगाए गए एलईडी के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स और रोशनी को अलग करने के लिए गोपनीयता फिल्म के साथ। (एफ) एलईडी बॉक्स के बाहरी एलईडी + गोपनीयता फिल्म संस्करण के अंदर एक मल्टीवेल डिश का प्लेसमेंट।

पूरक चित्रा 25: पावर स्विच और पोटेंशियोमीटर के लिए बॉक्स ढक्कन पर ड्रिलिंग छेद। (ए) बॉक्स ढक्कन के एनोटेट आयामों के साथ एक सीएडी ड्राइंग। (बी) पोटेंशियोमीटर और पावर स्विच छेद के साथ बॉक्स ढक्कन।

पूरक चित्रा 26: तार आउटलेट छेद तैयार करना। (ए) एनोटेटेड आयामों के साथ एक सीएडी ड्राइंग। (बी) ड्रिल बिट के साथ ड्रिल किए गए छेद की छवि। (सी) उच्च गति रोटरी उपकरण या फाइलिंग टूल के साथ आउटलेट छेद को चिकना करना। (डी) आउटलेट छेद में ग्रोममेट रखना।

पूरक चित्रा 27: बॉक्स में माइक्रोकंट्रोलर और पीसीबी का प्लेसमेंट। (ए) बॉक्स के अंदर माइक्रोकंट्रोलर धारक (नारंगी) और पीसीबी धारक। (बी) माइक्रोकंट्रोलर और पीसीबी बॉक्स में सुरक्षित हैं।

पूरक चित्रा 28: पोटेंशियोमीटर और पावर स्विच का प्लेसमेंट। (ए) पावर स्विच और चार पीओपीटी के साथ एक बॉक्स ढक्कन का सामने का दृश्य। (बी) पोटेंशियोमीटर नॉब्स के साथ बॉक्स ढक्कन का एक सामने का दृश्य जोड़ा गया। (सी) संलग्न घटकों के साथ बॉक्स ढक्कन का एक रियर व्यू।

पूरक चित्रा 29: इकट्ठे एलईडी नियंत्रण प्रणाली। (ए) एक खुला नियंत्रण बॉक्स जिसमें लेबल प्रिंटर के साथ लेबल किए गए तार और संगठन के लिए ज़िप बंधे होते हैं। (बी) एक बार बॉक्स पूरी तरह से इकट्ठा हो जाने के बाद पिन के साथ लेबल किए गए प्रत्येक पीओटी के साथ।

पूरक चित्र 30: क्रिम्प्ड वायर-टू-वायर कनेक्टर का प्लेसमेंट। (ए) चार एलईडी-माइक्रोकंट्रोलर सिस्टम के लिए क्रिम्प्ड वायर-टू-वायर कनेक्टर की तस्वीर। (बी) माइक्रोकंट्रोलर बंदरगाहों में क्रैम्प्ड कनेक्टर का प्लेसमेंट।

पूरक चित्र 31: जम्पर तारों को रखना। (ए) लाल जम्पर तारों के निर्देशांक के साथ लेबल किया गया एक सर्किट बोर्ड। (बी) पीले जम्पर तारों के निर्देशांक के साथ एक सर्किट बोर्ड लेबल किया गया है।

पूरक चित्र 32: जम्पर तारों को रखना। पीले जम्पर तारों के निर्देशांक प्रदर्शित करने वाला एक परिपथ बोर्ड.

पूरक चित्रा 33: वोल्टेज नियामकों को जोड़ना। एलएम 317 टी वोल्टेज नियामकों को आरेखों में लेबल किए गए उनके निर्देशांक के साथ सर्किट में जोड़ा जाता है।

पूरक चित्र 34: 820 ° प्रतिरोधकों को सम्मिलित करना। आरेखों में लेबल किए गए उनके निर्देशांक के साथ आर 1 प्रतिरोधकों को सर्किट में जोड़ा जाता है।

पूरक चित्र 35: ट्रांजिस्टर सम्मिलित करना। 2N2222A ट्रांजिस्टर को आरेखों में लेबल किए गए उनके निर्देशांक के साथ सर्किट में जोड़ा जाता है।

पूरक चित्र 36: POT कनेक्शन के लिए महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर्स और रेसिस्टर्स (वैकल्पिक) सम्मिलित करना। तारों और प्रतिरोधकों को आरेखों में लेबल किए गए उनके निर्देशांक के साथ सर्किट में जोड़ा जाता है। (ए) लाल तार डालें, इसके बाद आर 2 प्रतिरोधक (560) (केवल कम वोल्टेज सर्किट के लिए)। (बी) प्रतिरोधक के दूसरे छोर को संकेतित जमीन के छेद में डालें। (सी) जमीन से जुड़ने के लिए चिह्नित छेदों में काले तार डालें। नोट: R2 (560E) पोटेंशियोमीटर के समानांतर है।

पूरक चित्रा 37: माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन और बिजली की आपूर्ति के लिए पुरुष वायर-टू-वायर कनेक्टर डालना। तारों को आरेखों में लेबल किए गए उनके निर्देशांक के साथ सर्किट में जोड़ा जाता है। (ए) संकेतित छेदों में लाल तार डालें। (बी) काले तारों को चिह्नित छेदों में डालें।

पूरक चित्रा 38: एलईडी वायर-टू-वायर कनेक्टर जोड़ना। (ए) लाल लीड निर्देशांक के साथ महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर पर प्रकाश डाला गया। (बी) ब्लैक लीड निर्देशांक के साथ महिला वायर-टू-वायर कनेक्टर पर प्रकाश डाला गया।

पूरक चित्रा 39: एक PhyB-PIF3 जीन स्विच प्रयोग स्थापित करना। (ए) आंतरिक नियंत्रण के लिए रेनिला युक्त मास्टर मिश्रण की एक उदाहरण तालिका। (बी) एक फीबी-पीआईएफ 3 ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग के दोहरे-लूसिफेरस रिपोर्टर परख के लिए डीएनए मिश्रण स्थापित करने के लिए एक उदाहरण तालिका। (सी) पीईआई अभिकर्मक अभिकर्मक स्थापित करने और मिश्रण को कोशिकाओं पर जोड़ने के लिए एक उदाहरण तालिका (ड्रॉपवाइज)। (डी) एलईडी चमक सेट करने के लिए प्रकाश मीटर का प्लेसमेंट।

Discussion

यहां वर्णित एलईडी प्रणाली का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में कई ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के साथ अनुकूलन, विशेषता और काम करने के लिए किया गया है। किरियाकाकिस एट अल.4 में, हमने समानांतर में फीबी-पीआईएफ जीन स्विच के कई संयोजनों का परीक्षण किया। फिर हमने जीन स्विच कैनेटीक्स और प्रभावी प्रकाश तीव्रता को मापने के लिए विभिन्न आवृत्तियों पर प्रकाश की दालों का परीक्षण करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया। इस प्रणाली का उपयोग दो ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को अनुकूलित करने और चिह्नित करने के लिए भी किया गया था जो उत्तेजना 5,6 के लिए नीली रोशनी का उपयोग करते हैं। चूंकि अधिकांश ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को सक्रिय करने के लिए केवल एक एलईडी को पर्याप्त उज्ज्वल होने की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रत्येक कुएं पर बड़ी संख्या में एलईडी के साथ एक प्रणाली खरीदना हमेशा आवश्यक नहीं होता है। यह सेटअप सस्ती, विश्वसनीय, पुन: कॉन्फ़िगर करने में आसान है, और असेंबली प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए कोई पूर्व विद्युत विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है।

पूरक पूरक आंकड़े 31-38 में, हम वर्णन करते हैं कि सिस्टम में चार एलईडी को कैसे शामिल किया जाए। हालांकि यह बड़ी संख्या में समानांतर स्थितियों की आवश्यकता वाले कुछ प्रयोगों को सीमित कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली 9 वोल्ट बिजली की आपूर्ति को उच्च वाट क्षमता के साथ बदलकर अधिक एलईडी जोड़े जा सकते हैं। इसी तरह, कई कम शक्ति वाले एलईडी को प्रत्येक सर्किट के समानांतर जोड़ा जा सकता है। इस बाद की व्यवस्था में, कुछ एलईडी को व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित नहीं किया जाएगा, लेकिन यह तब उपयोगी हो सकता है जब एक बड़े क्षेत्र को कवर करने के लिए कई एलईडी की आवश्यकता होती है। एक बार इस प्रणाली के इलेक्ट्रॉनिक्स से परिचित होने के बाद, इसे अनुकूलित करने के कई तरीके हैं। सिस्टम को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त रणनीतियों में एलईडी को नमूने के दूर या करीब रखना और समरूप रोशनी की स्थिति के लिए फिल्टर / डिफ्यूज़र के माध्यम से रोशन करना या हीटिंग को रोकना शामिल है (पूरक चित्र 23) और एलन एट अल.5। हमारे एलईडी डिजाइन की एक और उल्लेखनीय विशेषता यह है कि यह एपॉक्सी में समझाया गया है और इसमें पीठ पर एक टच फास्टनर है; यह एलईडी को लगभग कहीं भी आसानी से सुरक्षित रूप से रखा जा सकता है: इनक्यूबेटर, मछली के टैंक, पशु पिंजरों, दीवारों आदि में।

जीन, सिग्नलिंग मार्गों और अन्य सेलुलर गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करने वाले कई प्रयोगों को अक्सर स्पंदन की आवश्यकता होती है, बड़े समय के पैमाने पर विस्तार ति किया जाता है, या इनक्यूबेटर में प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, इसलिए माइक्रोस्कोप के बिना स्वचालितकरण या रिमोट मैनिपुलेशन की आवश्यकता होती है। इस एलईडी प्रणाली को बिना किसी समस्या के ह्यूमिडिफायर सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर कई महीनों तक लगातार परीक्षण किया गया है। इसके अतिरिक्त, PhyB ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम जैसे प्रतिवर्ती प्रणालियों के साथ, प्रयोगकर्ता को प्रोग्राम-विशिष्ट स्पंदन रोशनी शेड्यूल की आवश्यकता हो सकती है। हमारे पिछले काम4 में, हमने उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में PhyB-PIF3 स्विच की रिवर्सबिलिटी गतिशीलता का परीक्षण करने के लिए स्पंदन कार्यक्रमों का उपयोग किया। इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति का उपयोग करते हुए, एक स्पंदन प्रोटोकॉल प्रोग्रामिंग आसान है, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से कई प्रकार के ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए आवश्यक लचीलापन और स्वायत्तता प्रदान करता है।

इस प्रणाली के निर्माण में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में पीसीबी बोर्ड पर विद्युत सर्किट को एक साथ रखना और घटकों को जोड़ना शामिल है, जो खंड 1 और खंड 2 में विस्तृत हैं। इन अनुभागों में प्रत्येक चरण का सावधानीपूर्वक पालन करना और प्रत्येक घटक को सोल्डर करने से पहले पिनहोल संख्याओं को लाइन-दर-लाइन दोबारा जांचना आवश्यक है। खंड 2 बताता है कि सर्किट से जुड़े घटकों को कैसे सेट किया जाए। ताकि घटक सही अभिविन्यास में जुड़ते हैं, यह सुनिश्चित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि तार-से-तार कनेक्टर पर काले और लाल तारों के रंग मेल खाते हैं। इन दो खंडों में छोटी निगरानी सिस्टम की कार्यक्षमता को प्रभावित करेगी। दरअसल, इस विधि के समस्या निवारण में पहला कदम यह जांचना होगा कि सर्किट सही ढंग से बनाया गया था और सभी कनेक्शन जगह में हैं। दूसरे, ढीले कनेक्शन के लिए सोल्डरिंग गुणवत्ता और तारों को फैलाने के लिए तारों की जांच करना जो सर्किट को शॉर्ट कर सकते हैं, विशेष महत्व का है। एक तीसरा कदम यह सुनिश्चित करना होगा कि एलईडी सही ढंग से काम कर रहे हैं, जिसे एलिगेटर क्लिप के साथ एलईडी के दो टर्मिनलों को क्लिप करके बिजली की आपूर्ति या 1.5 वी बैटरी का उपयोग करके किया जा सकता है। एक और संभावित महत्वपूर्ण विचार हीटिंग को रोकना है (उच्च शक्ति पर एलईडी का उपयोग करते समय) या व्यापक प्रसार रोशनी के लिए प्रकाश को अलग करना। इन विचारों को संबोधित करने के लिए, एलईडी को अंदर की ओर "गोपनीयता फिल्म" के साथ एक ब्लैक बॉक्स के बाहर रखा जा सकता है, जैसा कि पूरक चित्र 23 और एलन एट अल.5 में वर्णित है। इस प्रणाली की सादगी के कारण, मॉड्यूलर घटकों को सत्यापित करने, संशोधित करने, अपग्रेड करने या मरम्मत करने के लिए इसे अलग करना मुश्किल नहीं है।

इंड्यूसेबल जीन सिस्टम के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक यह विचार करना है कि जैविक प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए कितनी सक्रियता की आवश्यकता है या कितना रिसाव स्वीकार्य है। जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है, ये रिपोर्टर डीएनए की मात्रा के साथ भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, अभिकर्मक दक्षता और इसलिए, प्रत्येक सेल में रिपोर्टर संरचनाओं की प्रतिलिपि संख्या अलग-अलग होगी। कुछ प्रयोगों के लिए रिपोर्टर या फाइब जीन-स्विच घटकों की एक निश्चित मात्रा के साथ एक सेल लाइन बनाना फायदेमंद हो सकता है और प्रेरित अभिव्यक्ति की वांछित सीमा के साथ क्लोन के लिए स्क्रीन हो सकती है, जैसा कि आमतौर पर दवा इंड्यूसेबल सिस्टम के साथ किया जाता है। लेंटिवायरल प्लास्मिड पीपीके -2304 के आकार और अस्थिरता के कारण, हमने पीसीडीएनए बैकबोन पीपीके -351 (एडजीन # 157921) और पीपीके -352 (एडजीन # 157922) में फाइब स्विच के गैर-लेंटिवायरल प्लास्मिड संस्करण भी बनाए।

इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इस एलईडी रोशनी प्रणाली का निर्माण करके, उपयोगकर्ताओं के पास विट्रो और विवो में ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला करने के लिए आवश्यक सभी घटक हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में PhyB-PIF3 का उपयोग करने के निर्देशों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल गैर-इंजीनियरों और जीवविज्ञानियों को लचीले और प्रभावी ढंग से, विभिन्न संदर्भों में PhyB-आधारित ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करने की अनुमति देगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम एलईडी सिस्टम के विभिन्न संस्करणों का परीक्षण करने के लिए यिंगशियाओ (पीटर) वांग, जिलियांग हुआंग और मौली एलन को धन्यवाद देना चाहते हैं क्योंकि इसे विकसित किया जा रहा था। इस काम को यूसी सैन डिएगो में कावली इंस्टीट्यूट फॉर ब्रेन एंड माइंड और साल्क इंस्टीट्यूट, नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा ग्रांट सीसीएफ -0939370, एनआईएच ग्रांट एनएस 060847 और एनआईएच ग्रांट आर 21 डीसी018237 के तहत एनएसएफ सेंटर फॉर साइंस ऑफ इंफॉर्मेशन के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

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Farred LED 720nm Luxeon Star LEDs LXML-PF01 Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base"
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Farred LED 740nm Ushio EDC740D-1100-S5 Uses "STAR XP 3535" base
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Farred LED 780nm Ushio EDC780D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm Ushio EDC810D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm Ushio EDC850D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
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Red LED Digikey LXM3-PD01 LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
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Solder for soldering wires and circuit components Amazon Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) These are very common and there are many equivalents.
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Voltage regulator Newark LM317T Equivilent to NTE956.
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Windows 10 tablet Amazon B08BYTT79Y Any Windows 10 PC will do.
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Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 ATCC ATCC CRL-1573 Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose ThermoFisher 11965−092 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin ThermoFisher 15140122 These are very common and there are many equivalents.
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White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates ThermoFisher 07-200-589 White plates are preferred. Do not use clear plates.
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PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) PolySciences 24765-1 Can be replaced with another transfection reagent.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm) Amazon Proskit 1PK-037S These are very common and there are many equivalents.
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Dremil 3000 with cutting tool and grinder Amazon Dremel 3000 Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool Amazon Dremel 200-1/15 Any similar Dremil will work.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip Amazon Dremel 84922 Silicon Carbide Grinding Stone.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT Amazon DS017 For removing solder/mistakes.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass Amazon SE MZ101B These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers Amazon Hakko CHP PN-20-M Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers Amazon Wiha 26197 These are very common and there are many equivalents.
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Soldering iron Amazon Yihua 939D+ Digital Soldering Station These are very common and there are many equivalents.
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TraceTech No-Clean Flux Pen Amazon 2507-N Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL.
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Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber Amazon WSA350 For soldering safety.
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Wire strippers Amazon CSP-30-7 These are very common and there are many equivalents.
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IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG Amazon IWS-3220M These are very common and there are many equivalents.
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