زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي
Summary
وصفنا طريقة لإعداد والتصوير الحي للمقتطفات السيتوبلازمية غير المخففة من بيض Xenopus laevis .
Abstract
تستخدم مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا للمقايسات البيوكيميائية السائبة ، وقد ظهرت كأداة قوية قائمة على التصوير لدراسة الظواهر السيتوبلازمية ، مثل التحريك الخلوي وتشكيل المغزل الانقسامي وتجميع النواة. بناء على الطرق المبكرة التي صورت المستخلصات الثابتة التي تم أخذ عينات منها في نقاط زمنية متفرقة ، تقوم الأساليب الحديثة بتصوير المقتطفات الحية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، مما يكشف عن ميزات أكثر ديناميكية مع دقة زمنية محسنة. تتطلب هذه الطرق عادة معالجات سطحية متطورة لوعاء التصوير. نقدم هنا طريقة بديلة للتصوير الحي لمستخلصات البيض التي لا تتطلب معالجة سطحية كيميائية. من السهل تنفيذ واستخدام المواد الاستهلاكية المختبرية ذات الإنتاج الضخم للتصوير. وصفنا نظاما يمكن استخدامه لكل من الفحص المجهري واسع المجال والبؤر. وهي مصممة لمقتطفات التصوير في مجال ثنائي الأبعاد (2D) ، ولكن يمكن تمديدها بسهولة إلى التصوير في 3D. إنه مناسب تماما لدراسة تكوين النمط المكاني داخل السيتوبلازم. من خلال البيانات التمثيلية ، نوضح التنظيم الديناميكي النموذجي للأنابيب الدقيقة والنوى والميتوكوندريا في مستخلصات الطور البيني المحضرة باستخدام هذه الطريقة. يمكن أن توفر بيانات الصور هذه معلومات كمية عن ديناميكيات السيتوبلازم والتنظيم المكاني.
Introduction
يشكل السيتوبلازم الحجم الرئيسي للخلية وله تنظيم متميز. يمكن أن تتجمع مكونات السيتوبلازم حقيقي النواة ذاتيا في مجموعة واسعة من الهياكل المكانية ، مثل زهور النجمة microtubule وجهاز Golgi ، والتي بدورها يتم ترتيبها ديناميكيا وقلبها اعتمادا على هوية الخلية وحالتها الفسيولوجية. وبالتالي فإن فهم التنظيم المكاني للسيتوبلازم وارتباطه بالوظائف الخلوية مهم لفهم كيفية عمل الخلية. تم استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا في المقايسات البيوكيميائية السائبة1،2،3،4،5،6،7،8 ، لكن العمل الأخير يؤسسها كنظام تصوير حي قوي للدراسات الميكانيكية للهياكل السيتوبلازمية ووظائفها الخلوية9،10،11 ، 12،13،14،15،16،17،18. تحافظ هذه المستخلصات غير المخففة على العديد من هياكل ووظائف السيتوبلازم ، مع السماح بالتلاعب المباشر بمحتويات السيتوبلازم التي لا يمكن تحقيقها في النماذج التقليدية القائمة على الخلايا19,20. هذا يجعلها مثالية لتوصيف الظواهر السيتوبلازمية وتشريح أسسها الميكانيكية.
تتطلب الطرق الحالية لمستخلصات التصوير تعديلات على السطح الكيميائي ، أو تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة. تتطلب إحدى الطرق القائمة على غطاء الغطاء تخميل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لأغطية الزجاج21. تتطلب الطريقة القائمة على المستحلب الدقيق ترسب بخار ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الأسطح الزجاجية22,23. تسمح الأنظمة القائمة على الموائع الدقيقة بالتحكم الدقيق في حجم وهندسة وتكوين قطرات الاستخراج ، ولكنها تتطلب مرافق تصنيع دقيقة متخصصة11،12،24.
نقدم هنا طريقة بديلة لتصوير مستخلصات البيض سهلة التنفيذ وتستخدم مواد متاحة بسهولة ومنخفضة التكلفة. يتضمن ذلك تحضير غرفة تصوير مع شريحة وغطاء مغطى بشريط بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP). يمكن استخدام الغرفة لتصوير المستخلصات مع مجموعة متنوعة من أنظمة الفحص المجهري ، بما في ذلك المجاهر المجسمة والمجاهر المستقيمة والمقلوبة. لا تتطلب هذه الطريقة أي معالجة كيميائية للأسطح مع تحقيق وضوح بصري مماثل تم الحصول عليه باستخدام الطرق القائمة على الزجاج التي تمت مناقشتها أعلاه. وهي مصممة لتصوير طبقة من مقتطفات بسمك موحد عبر حقل 2D ، ويمكن تمديدها بسهولة لتصوير حجم 3D من المستخلصات. إنه مناسب تماما للتصوير بفاصل زمني للسلوك السيتوبلازمي الجماعي على مجال رؤية كبير.
لقد استخدمنا مستخلصات البيض البينية المحتجزة لتوضيح طريقة التصوير لدينا. يتبع إعداد المستخلص بروتوكول Deming و Kornbluth19. باختصار ، يتم سحق البيض الذي يتم القبض عليه بشكل طبيعي في الطور الاستوائي من الانقسام الاختزالي الثاني عن طريق الدوران بسرعة منخفضة. يطلق هذا الدوران السيتوبلازم من الاعتقال الاختزالي ويسمح للمستخلص بالمضي قدما في الطور البيني. عادة ، يتم إضافة السيتوكلاسين B قبل الدوران الساحق لمنع تكوين F-actin. ومع ذلك ، يمكن حذفه إذا كان F-actin مطلوبا. يضاف Cycloheximide أيضا قبل الدوران الساحق لمنع مستخلص الطور البيني من دخول الانقسام التالي. يتم وضع المستخلصات لاحقا في غرف التصوير المذكورة أعلاه وتوضع على المجهر. أخيرا ، يتم تسجيل الصور بمرور الوقت على فترات زمنية محددة بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر ، مما ينتج عنه سلسلة صور بفاصل زمني تلتقط السلوك الديناميكي للمستخلص في حقل 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظهرت مستخلصات البيض Xenopus laevis كنظام نموذجي قوي للدراسات القائمة على التصوير لمختلف الهياكل تحت الخلوية10،14،15،16،17،18،21،31،32،33،34،35<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ج. كامينز و Y. Chen و W. Y. C. HUANG على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM110564 و P50 GM107615 و R35 GM131792) الممنوحة لجيمس إي فيريل جونيور.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
