Xenopus laevis Ægekstraktpræparation og levende billeddannelsesmetoder til visualisering af dynamisk cytoplasmisk organisation
Summary
Vi beskriver en metode til fremstilling og levende billeddannelse af ufortyndede cytoplasmatiske ekstrakter fra Xenopus laevis æg.
Abstract
Traditionelt anvendt til bulk biokemiske assays, Xenopus laevis ægekstrakter er opstået som et kraftfuldt billeddannelsesbaseret værktøj til at studere cytoplasmatiske fænomener, såsom cytokinesis, mitotisk spindeldannelse og samling af kernen. Baseret på tidlige metoder, der afbildede faste ekstrakter, der blev samplet på sparsomme tidspunkter, har de seneste tilgange billede live ekstrakter ved hjælp af time-lapse mikroskopi, der afslører mere dynamiske funktioner med forbedret tidsmæssig opløsning. Disse metoder kræver normalt sofistikerede overfladebehandlinger af billeddannelsesbeholderen. Her introducerer vi en alternativ metode til levende billeddannelse af ægekstrakter, der ikke kræver kemisk overfladebehandling. Det er nemt at implementere og bruger masseproducerede laboratorieforbrugsstoffer til billeddannelse. Vi beskriver et system, der kan bruges til både bredfelts- og konfokalmikroskopi. Det er designet til billeddannelsesekstrakter i et 2-dimensionelt (2D) felt, men kan let udvides til billeddannelse i 3D. Det er velegnet til at studere rumlig mønsterdannelse inden for cytoplasmaet. Med repræsentative data demonstrerer vi den typiske dynamiske organisering af mikrotubuli, kerner og mitokondrier i interfaseekstrakter fremstillet ved hjælp af denne metode. Disse billeddata kan give kvantitativ information om cytoplasmisk dynamik og rumlig organisation.
Introduction
Cytoplasmaet udgør hovedvolumenet af en celle og har en særskilt organisation. Ingredienserne i det eukaryote cytoplasma kan selv samles i en bred vifte af rumlige strukturer, såsom mikrotubulus asters og Golgi-apparatet, som igen er dynamisk arrangeret og vendt afhængigt af cellens identitet og fysiologiske tilstand. At forstå den rumlige organisation af cytoplasmaet og dets forbindelse til cellulære funktioner er således vigtigt for at forstå, hvordan cellen fungerer. Xenopus laevis ægekstrakter er traditionelt blevet brugt til bulk biokemiske assays 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyere arbejde etablerer dem som et kraftfuldt levende billeddannelsessystem til mekanistiske undersøgelser af cytoplasmatiske strukturer og deres cellulære funktioner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Disse ufortyndede ekstrakter bevarer mange strukturer og funktioner i cytoplasmaet, samtidig med at de tillader direkte manipulationer af cytoplasmatisk indhold, der ikke kan opnås i konventionelle cellebaserede modeller19,20. Dette gør dem ideelle til at karakterisere cytoplasmatiske fænomener og dissekere deres mekanistiske underlag.
Eksisterende metoder til billeddannelsesekstrakter kræver kemiske overflademodifikationer eller fremstilling af mikrofluidiske enheder. En coverslip-baseret metode kræver polyethylenglycol (PEG) passivering af glasdæksler21. En mikroemulsionsbaseret metode kræver dampaflejring af trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan på glasoverflader22,23. Mikrofluidbaserede systemer muliggør præcis kontrol af volumen, geometri og sammensætning af ekstraktdråber, men kræver specialiserede mikrofabrikationsfaciliteter11,12,24.
Her introducerer vi en alternativ metode til billeddannelse af ægekstrakter, der er let at implementere og bruger let tilgængelige, billige materialer. Dette omfatter fremstilling af et billeddannelseskammer med et dias og en dæksel belagt med fluoreret ethylenpropylen (FEP) tape. Kammeret kan bruges til billeddannelsesekstrakter med en række mikroskopisystemer, herunder stereoskoper og opretstående og inverterede mikroskoper. Denne metode kræver ingen kemisk behandling af overflader, samtidig med at der opnås lignende optisk klarhed opnået med eksisterende glasbaserede metoder, der er diskuteret ovenfor. Det er designet til at afbilde et lag af ekstrakter med en ensartet tykkelse over et 2D-felt og kan let udvides til at afbilde et 3D-volumen ekstrakter. Det er velegnet til time-lapse-billeddannelse af kollektiv cytoplasmisk adfærd over et stort synsfelt.
Vi har brugt interfase-arresterede ægekstrakter til at demonstrere vores billeddannelsesmetode. Ekstraktpræparatet følger protokollen for Deming og Kornbluth19. Kort fortalt knuses æg, der naturligt arresteres i metafase af meiose II, af et lavt hastighedsspin. Dette spin frigiver cytoplasmaet fra meiotisk anholdelse og tillader ekstraktet at fortsætte ind i interfase. Normalt tilsættes cytochalasin B før knusningsspin for at hæmme dannelsen af F-actin. Det kan dog udelades, hvis F-actin ønskes. Cycloheximid tilsættes også før knusningsspin for at forhindre interfaseekstraktet i at komme ind i den næste mitose. Ekstrakterne placeres efterfølgende i de førnævnte billeddannelseskamre og placeres på et mikroskop. Endelig optages billeder over tid med definerede intervaller af et kamera, der er forbundet til mikroskopet, hvilket producerer time-lapse-billedserier, der fanger ekstraktets dynamiske opførsel i et 2D-felt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis ægekstrakter er opstået som et kraftfuldt modelsystem til billeddannelsesbaserede undersøgelser af forskellige subcellulære strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 og cytoplasmatisk organisation i det hele taget</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker J. Kamenz, Y. Chen og W. Y. C. Huang for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 og R35 GM131792) tildelt James E. Ferrell, Jr.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
