제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법
Summary
우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.
Abstract
전통적으로 대량 생화학 분석에 사용되는 Xenopus laevis 계란 추출물은 세포질 분열, 유사분열 방추 형성 및 핵 조립과 같은 세포질 현상을 연구하기 위한 강력한 이미징 기반 도구로 부상했습니다. 희박한 시점에서 샘플링된 고정 추출물을 이미지화하는 초기 방법을 기반으로 하는 최근의 접근 방식은 타임랩스 현미경을 사용하여 라이브 추출물을 이미지화하여 향상된 시간 해상도로 보다 역동적인 특징을 드러냅니다. 이러한 방법은 일반적으로 이미징 용기의 정교한 표면 처리가 필요합니다. 여기에서는 화학적 표면 처리가 필요하지 않은 계란 추출물의 라이브 이미징을 위한 대체 방법을 소개합니다. 구현이 간단하고 대량 생산된 실험실 소모품을 이미징에 활용합니다. 우리는 광시야 및 컨포칼 현미경 모두에 사용할 수 있는 시스템을 설명합니다. 2차원(2D) 분야의 이미징 추출물을 위해 설계되었지만 3D 이미징으로 쉽게 확장할 수 있습니다. 세포질 내에서 공간 패턴 형성을 연구하는 데 적합합니다. 대표적인 데이터를 통해 우리는 이 방법을 사용하여 제조된 간기 추출물에서 미세소관, 핵 및 미토콘드리아의 전형적인 동적 조직을 보여줍니다. 이러한 이미지 데이터는 세포질 역학 및 공간 조직에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다.
Introduction
세포질은 세포의 주요 부피를 구성하며 뚜렷한 조직을 가지고 있습니다. 진핵 세포질의 성분은 미세 소관 과꽃 및 골지체와 같은 광범위한 공간 구조로 자체 조립 될 수 있으며, 이는 세포의 정체성과 생리적 상태에 따라 동적으로 배열되고 뒤집어집니다. 따라서 세포질의 공간적 조직과 세포 기능과의 연관성을 이해하는 것은 세포가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 중요합니다. Xenopus laevis 계란 추출물은 전통적으로 벌크 생화학 분석 1,2,3,4,5,6,7,8에 사용되어 왔지만 최근의 연구는 세포질 구조 및 세포 기능에 대한 기계 론적 연구를위한 강력한 라이브 이미징 시스템으로 확립되었습니다 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. 이들 희석되지 않은 추출물은 세포질의 많은 구조 및 기능을 보존하는 한편, 종래의 세포 기반 모델(19,20)에서는 달성할 수 없는 세포질 내용물의 직접 조작을 허용한다. 이것은 세포질 현상을 특성화하고 기계적 토대를 해부하는 데 이상적입니다.
추출물을 이미징하기 위한 기존의 방법은 화학적 표면 개질 또는 미세유체 장치의 제조를 필요로 한다. 하나의 커버슬립-기반 방법은 유리 커버슬립(21)의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 패시베이션을 필요로 한다. 마이크로 에멀젼 기반 방법은 유리 표면22,23에 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H- 퍼플 루오로 옥틸) 실란의 증착을 필요로한다. 미세유체 기반 시스템은 추출물 액적의 부피, 형상 및 조성을 정밀하게 제어할 수 있지만, 특수한 미세가공 설비(11,12,24)가 필요하다.
여기에서는 구현하기 쉽고 쉽게 구할 수 있는 저렴한 재료를 활용하는 계란 추출물을 이미징하는 대체 방법을 소개합니다. 여기에는 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 테이프로 코팅된 슬라이드와 커버슬립이 있는 이미징 챔버의 준비가 포함됩니다. 이 챔버는 입체경과 정립 및 도립 현미경을 포함한 다양한 현미경 시스템으로 추출물을 이미징하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 위에서 논의한 기존 유리 기반 방법으로 얻은 유사한 광학 선명도를 달성하면서 표면의 화학적 처리가 필요하지 않습니다. 2D 필드에 걸쳐 균일한 두께의 추출물 층을 이미지화하도록 설계되었으며 추출물의 3D 볼륨을 이미지화하도록 쉽게 확장할 수 있습니다. 넓은 시야에서 집단 세포질 행동의 타임 랩스 이미징에 매우 적합합니다.
우리는 이미징 방법을 시연하기 위해 간기 정지 계란 추출물을 사용했습니다. 추출물 제제는 Deming 및 Kornbluth19의 프로토콜을 따릅니다. 간단히 말해서, 감수 분열 II의 중기에서 자연적으로 체포 된 난자는 저속 스핀에 의해 분쇄됩니다. 이 스핀은 감수 분열 정지로부터 세포질을 방출하고 추출물이 간기로 진행되도록합니다. 일반적으로, 사이토칼라신 B는 F-액틴 형성을 억제하기 위해 분쇄 스핀 전에 첨가된다. 다만, F-액틴이 필요한 경우에는 생략할 수 있다. 사이클로헥시미드는 또한 간기 추출물이 다음 유사분열로 들어가는 것을 방지하기 위해 분쇄 스핀 전에 첨가됩니다. 추출물은 이후 전술한 이미징 챔버에 배치되고 현미경에 놓입니다. 마지막으로, 현미경에 연결된 카메라에 의해 정의된 간격으로 시간이 지남에 따라 이미지가 기록되어 2D 필드에서 추출물의 동적 동작을 캡처하는 타임랩스 이미지 시리즈를 생성합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis 계란 추출물은 다양한 세포 내 구조 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 및 세포질 조직 전체에 대한 이미징 기반 연구를위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다.<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 의견을 주신 J. Kamenz, Y. Chen 및 W. Y. C. Huang에게 감사드립니다. 이 작업은 James E. Ferrell, Jr.에게 수여된 국립 보건원(R01 GM110564, P50 GM107615 및 R35 GM131792)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
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