Method Article

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

DOI:

10.3791/61925

⸱

May 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Inserm, C3M, Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, Nice, France

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

adipocyte 기능의 변경은 타입-2 당뇨병및 인슐린 저항을 포함하여 신진 대사 질병의 병발생에 기여합니다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 지방세포에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 이 논문은 소염성 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 후색 성 전환체에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하고, 소염포 세포로 소명 섬유아세포를 분화시키는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 성숙한 송신세포가 첨가되는 세포 배양판에서 복합체를 형성하기 위해 트랜스페션 시약및 올리고뉴클레오티드의 배양을 포함한다. 그런 다음 고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체가 있는 경우 부착판 표면에 다시 부착할 수 있다. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 리포발생 및 lipolypolysis의 연구와 같은 기능성 분석은 단백질 또는 마이크로 RNA 조작이 백혈구 기능에 미치는 영향을 연구하기 위해 트랜스페드 3T3-L1 성숙한 지방세포에서 수행될 수 있다.

Introduction

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비만은 인슐린 저항성 (IR), 타입-2 당뇨병 (T2D), 및 심장 혈관 질병을 포함하여 수많은 신진 대사 질병을 위한 중요한 위험 요소로 간주됩니다1. 현재 치료는 이 질병의 끊임없이 상승 보급을 중단하는 것을 실패하고, 비만과 당뇨병 환자의 IR의 관리는 중요한 임상 문제점 남아 있습니다. 지방 조직은 에너지 항상성의 제어에 중요한 역할을하며, 비만 중 병리학적 확장은 IR 및 T2D2,3의개발에 기여한다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 많은 연구 결과는 지방 세포 생리학에 있는 단백질 코딩 RNA의 역할 및 비만과의 그들의 협회를 조사했습니다.

최근에는 비코딩 RNA(ncRNA), 특히 마이크로 RNA(miRs)의 발견은 유전자 발현 프로그램의 조절 메커니즘과 관련된 새로운 개념을 위조했다. 연구 결과는 ncRNA가 adipocyte 기능의 중요한 레귤레이터이고, 그들의 dysregulation는 신진 대사 질병4에중요한 역할을 한다는 것....

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Protocol

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참고: 멸균 기술을 사용하여 라미나르 유동 세포 배양 후드에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다. 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 뮤린 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포로 분화

  1. 3T3-L1 섬유아세포는 피루바테 없이 배양 배지-DMEM, 25mM 포도당, 10% 신생아 종아리 혈청, 1% 페니실린 및 연쇄절제술(도1A)으로 3T3-L1섬유아세포를 성장시한다. 조직 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에 접시를 놓습니다.
  2. 인플루언서 후 이틀, 배양 배지를 변경, 피루바테, 25mM 포도당, 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 1% 페니실린 및 연쇄상 구균신으로 대체하여 0.25mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 0.25 μM dexamethasone, 5 μg/mL
    참고: 세포가 100mm 접시당 300,000개의 세포에서 종자될 때 합의에 도달하는 데 5일이 걸립니다.
  3. 이틀 후, 배양 배지를 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균시(1% 페니실린 및 연쇄상 구균)로 대체하여 5 μg/mL 인슐린과....

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Results

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3T3-L1 분광구에서 단백질 또는 마이크로 RNA의 발현을 조절하기 위해 여기에 설명된 역형 형질의 절차를 사용하여, 형포세포는 트랜스펙션 후 그들의 형태를 보존하는 것으로나타났다(도 1B,C). 실제로, 2일 후, 대포세포는 잘 퍼지고 접시에 부착되어 성숙한 3T3-L1 의 특징인 다중 지질 방울을 제시했다. 지질 함량은 전과 감염및 비과감염형(도1D,E)과다르지 않았다. 더욱이, 퍼록시소 증식활성 수용체 감마2(Pparγ2),아디포넥틴(Adipoq), 포도당 수송기 4 또는 솔루트 캐리어 패밀리 2 멤버와 같은 분화 마커의 mRNA 발현 4(Slc2a4),인슐린 수용체 기판 1(Irs1),perilipin-1(Plin1)은비 과감염 된 .......

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Discussion

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이 논문은 성숙한 지방세포의 분화 및 트랜스포션을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 역형 형질 방법은 시나, 마이크로 RNA 모방, 항마이크로 RNA 모방, 항마이크로RNA 와 같은 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 가장 어려운 세포주 중 하나인 3T3-L1 아디포사이클로 전환하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 메서드에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 플라스미드 DNA를 가진 형질 전환에 대 한 효율적이 지 않습니다., 기능의 이득 연구에 대 한이 기술의 유용성을 제한 하는. 3T3-L1 세포주를 포함하는 뮤린 세포주, 전형적으로 체외에서 반포세포 기능을 연구하는 데 사용되었지만, 미세 RNA 발현 패턴 및 뮤린 조직에서의 활동은 종종 인간에서 관찰된 것과 다르다. 이것은 또한 1 차적인 세포 및 세포주를 가진 케이스입니다. 더욱이, 3T3-L1 섬유아세포의 분화에 사용되는 배지는 비생리성 호르몬 칵테일(인슐린, 덱사메타손, IBMX 및 로시글리타존)을 필요로 하며, 분화.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 INSERM, 유니버시테 코트 다쥐르, 프랑스 국립 연구기관(ANR)이 향후 우수 연구소(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)와 우수 이니셔티브(Idexex UCAJEDI ANR-15-IDEX)를 통해 지원되었습니다. J.J.는 소시에테 프랑코폰 뒤 디아베테(SFD), 협회 프랑수아즈 데 에뛰드 에 드 레베시테(AFERO), 인스티투트 테마티크 멀티 유기체 테크놀로지스 부어 라 산테(ITMO), 벤자민-데레서트의 보조금으로 지원된다. J.G.는 ANR-18-CE14-0035-01에 의해 지원됩니다. J-F.T.는 ANR 보조금 ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01및 퐁당 부어 라 레체르체 메디칼 (Equipe FRM, DEQ20180839587)에 의해 지원됩니다. 또한 GIS IBISA 현미경 검사법과 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원하는 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 도 감사합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12웰 조직 배양 플레이트Dutscher353043
2.5% 트립신(10x)Gibco15090-046D-PBS
2-프로판올시그마I9516
3-이소부틸-1-메틸크산틴, 시그마-알드리치D5879
Accell, 비표적화, 풀,호라이즌 디스커버리D-001910-10-05
소 혈청 알부민 (BSA)SigmaA7030
콜라겐 타입 I 송아지 피부에서Sigma-AldrichC8919
덱사메타손Sigma-AldrichD1756
D-PBSGibco14190144
Dulbecco's  변성 독수리 배지 (DMEM)Gibco419650624.5 g / L D- 포도당; L-글루타민; 피루브산
없음 에탄올Sigma51976
FAM 표지 음성 대조군 si-RNAInvitrogenAM4620
소 태아 혈청Gibco10270-106
유리 글리세롤 시약Sigma-AldrichF6428
글리세롤 표준 용액Sigma-AldrichG7793
HSP90 항체Santa Cruzsc-131119희석 : 0.5 & 마이크로; g/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)Gibco31985-047
인슐린, 인간 재조합Gibco12585-014
miRIDIAN micro-RNA 모방Horizon Discovery
miRNeasy Mini KitQiagen217004
miScript II RT KitQiagen218161
miScript Primer 분석 Hs_RNU6-2_11QiagenMS00033740
miScript Primer 분석 Mm_miR-34a_1QiagenMS00001428
miScript SYBR Green PCR KitQiagen219073
신생아 송아지 혈청Gibco16010-159
Oil Red OSigmaO0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpoolHorizon DiscoveryL-056623-01-0005
페니실린 및 스트렙토마이신Gibco15140-122
Perilipin-1 항체세포 신호 전달3470희석 : 1/1000
페트리 접시 100 mm x 20 mmDutscher353003
PKB 항체세포 신호 전달9272희석 : 1/1000
PKB Phospho Thr308 항체세포 신호9275희석 : 1/1000
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
형질주입 시약(INTERFERin)Polyplus409-10
α-tubulin 항체Sigma aldrichT6199희석 : 0.5 μm; g/mL
Vamp2 항체R& D 시스템MAB5136희석 : 0.1 & 마이크로; g/mL
, 로 5배로 희석, , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  2. Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.

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Adipocyte DifferentiationReverse TransfectionsiRNA TransfectionmiRNA Mimic3T3 L1 AdipocytesInsulin SignalingGlucose UptakeLipolysis AssayLipogenesis AssayCollagen Coating

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