حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos
Summary
تعتمد العديد من خصائص eusociality للحشرات على التواصل داخل المستعمرة وتقسيم العمل. يوفر التلاعب الجيني للجينات التنظيمية الرئيسية في أجنة النمل عن طريق الحقن المجهري والطفرات بوساطة كريسبر نظرة ثاقبة لطبيعة السلوك الإيثاري في الحشرات الاجتماعية.
Abstract
يتم التحكم في السمات الفريدة للحشرات eusocial ، مثل السلوك الاجتماعي والتقسيم التناسلي للعمل ، من خلال نظامها الوراثي. لمعالجة كيفية تنظيم الجينات للسمات الاجتماعية ، قمنا بتطوير النمل الطافر عن طريق توصيل مركب كريسبر إلى أجنة صغيرة خلال مرحلتها المخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولا للطفرات بوساطة كريسبر في Harpegnathos saltator ، وهو نوع من النمل ponerine الذي يظهر مرونة مظهرية مذهلة. يتم تربية النمل المملح H. بسهولة في بيئة معملية. يتم جمع الأجنة للحقن المجهري مع بروتينات Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي الصغير المركب في المختبر (sgRNAs) باستخدام إبر الكوارتز محلية الصنع. يتم تربية الأجنة بعد الحقن خارج المستعمرة. بعد ظهور اليرقة الأولى ، يتم نقل جميع الأجنة واليرقات إلى صندوق عش مع عدد قليل من عمال التمريض لمزيد من التطوير. هذا البروتوكول مناسب لإحداث طفرات لتحليل فسيولوجيا الطبقة والسلوك الاجتماعي في النمل ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا على مجموعة أوسع من غشاء البكارة والحشرات الأخرى.
Introduction
أدى تطور eusociality في الحشرات ، أي تلك الموجودة في رتب غشائيات الأجنحة و Blattodea (Isoptera سابقا) ، إلى سمات سلوكية فريدة ومتطورة في كثير من الأحيان تظهر على مستوى الفرد والمستعمرة. غالبا ما يتضمن التقسيم الإنجابي للعمل ، وهي سمة تميز المجموعات الأكثر تقدما من الحشرات الاجتماعية ، أنظمة طبقية تتكون من عدة مجموعات مميزة سلوكيا وغالبا ما تكون مورفولوجيا. يتم التحكم في هذا التنوع السلوكي والمورفولوجي بين الطوائف ليس فقط من خلال نظامها الجيني ، ولكن أيضا في كثير من الأحيان من خلال البيئة1،2،3،4 ، مما يجعل الحشرات eusocial مواضيع جذابة للبحوث الوراثية واللاجينية.
أثبتت القدرة على التلاعب بالنظام الجيني للحشرات الاجتماعية أنها صعبة لأن العديد من الأنواع لا تتزاوج وتتكاثر في البيئات المختبرية. تحتوي معظم الحشرات الاجتماعية أيضا على عدد قليل جدا من الأفراد التناسلية في مستعمرة ، مما يحد من عدد النسل الذي يمكن إنتاجه وبالتالي يحد من حجم العينة للتلاعب الجيني5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الحشرات eusocial لها أوقات جيل طويلة مقارنة بالحشرات المستخدمة عادة في الدراسات الجينية (مثل ذبابة الفاكهة) ، مما يزيد من صعوبة إنشاء خطوط وراثية5. ومع ذلك ، يمكن لبعض الأنواع eusocial أن تولد نسبة كبيرة من الأفراد النشطين تناسليا في مستعمرة ، مما يخفف من التحديات ويوفر فرصا لإنشاء خطوط متحولة أو معدلة وراثيا.
في حالة أنواع النمل ponerine ، Harpegnathos saltator ، يمكن لجميع العاملات أن يصبحن نشطات في الإنجاب عند وفاة الملكة أو العزلة الاجتماعية. يشار إلى هؤلاء العمال باسم “gamergates” ويمكن استخدامهم لإنشاء مستعمرات جديدة6. علاوة على ذلك ، قد يكون هناك أكثر من بوابة لاعب واحدة موجودة في مستعمرة ، وبالتالي زيادة إنتاج النسل5،7،8. حتى الآن ، تم تطوير سلالات متحولة و / أو معدلة وراثيا في نحل العسل الأوروبي ، Apis mellifera ، وفي أنواع النمل ، H. saltator ، Ooceraea biroi ، و Solenopsis invicta9،10،11،12،13،14،15 . مهدت التحليلات الجينية في النحل والنمل الاجتماعي الطريق نحو فهم أفضل لل eusociality ، وتوفير مجموعة من الفرص لدراسة الجينات وتأثيراتها على سلوك الحشرات eusocial وعلم وظائف الأعضاء الخاصة بالطبقة.
هنا ، نقدم بروتوكولا للتعديل الوراثي عبر نظام CRISPR / Cas9 في H. saltator. على وجه التحديد ، تم استخدام هذه التقنية لتوليد طفرة جرثومية في orco ، الجين الذي يشفر المستقبل المشترك الملزم لجميع مستقبلات الرائحة (ORs)10. تم توسيع جينات OR بشكل ملحوظ في الحشرات eusocial غشاء البكارة16 ، ويلعب orco دورا أساسيا في حاسة الشم الحشرية. في حالة عدم وجودها ، لا تتجمع غرف العمليات أو تعمل بشكل طبيعي. وبالتالي ، فإن طفرات جين orco تعطل الإحساس الشمي والتطور العصبي والسلوكيات الاجتماعية المرتبطة 9,10.
في هذا البروتوكول ، يتم إدخال بروتينات Cas9 و RNAs الموجهة الصغيرة (sgRNAs) في أجنة النمل باستخدام الحقن المجهري لغرض إحداث طفرات في الجين المستهدف. هنا ، سنصف إجراء الحقن المجهري بالتفصيل جنبا إلى جنب مع التوجيهات المتعلقة برعاية المستعمرات والأجنة المحقونة. هذه الطرق مناسبة لإحداث الطفرات في مجموعة متنوعة من الجينات المختلفة في النمل المملح ويمكن تطبيقها على مجموعة أوسع من حشرات غشاء البكارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدى تطور eusociality بين الحشرات ، بما في ذلك النمل والنحل والدبابير والنمل الأبيض ، إلى ظهور سمات سلوكية ومورفولوجية جديدة ، يفهم أن الكثير منها يتأثر بمجموعة من العوامل البيئية والوراثية1،2،3،4. لسوء الحظ ، فإن جاذبية وفائد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مختبرات داني راينبرغ وكلود ديسبلان في جامعة نيويورك ومختبر يورغن ليبيغ في جامعة ولاية أريزونا لدعمهم في علم الوراثة النمل. تقر هوا يان بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم I / UCRC ، ومركز تقنيات إدارة المفصليات بموجب المنحة رقم IIP-1821914 ومن قبل شركاء الصناعة. تم دعم مايا سار من قبل صندوق البحث والتطوير الزراعي ثنائي القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل ، زمالة Vaadia-BARD لما بعد الدكتوراه رقم FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
