Embryoinjektioner för CRISPR-medierad mutagenes i Ant Harpegnathos saltator
Summary
Många egenskaper hos insektseusocialitet är beroende av kommunikation och arbetsfördelning inom kolonin. Genmanipulation av viktiga reglerande gener i myrembryon via mikroinjektion och CRISPR-medierad mutagenes ger insikter om arten av altruistiskt beteende hos eusociala insekter.
Abstract
De unika egenskaperna hos eusociala insekter, såsom socialt beteende och reproduktiv arbetsfördelning, styrs av deras genetiska system. För att ta itu med hur gener reglerar sociala egenskaper har vi utvecklat mutanta myror via leverans av CRISPR-komplex till unga embryon under deras syncytialstadium. Här tillhandahåller vi ett protokoll över CRISPR-medierad mutagenes i Harpegnathos saltator, en ponerinmyrart som uppvisar slående fenotypisk plasticitet. H. saltatormyror föds lätt upp i laboratoriemiljö. Embryon samlas in för mikroinjektion med Cas9-proteiner och in vitro-syntetiserade små guide-RNA (sgRNA) med hjälp av hemmagjorda kvartsnålar. Embryon efter injektion föds upp utanför kolonin. Efter uppkomsten av den första larven transporteras alla embryon och larver till en holk med några vårdpersonal för vidare utveckling. Detta protokoll är lämpligt för att inducera mutagenes för analys av kastspecifik fysiologi och socialt beteende hos myror, men kan också tillämpas på ett bredare spektrum av hymenopteraner och andra insekter.
Introduction
Utvecklingen av eusocialitet hos insekter, nämligen de av ordningarna Hymenoptera och Blattodea (tidigare Isoptera), har resulterat i unika och ofta sofistikerade beteendedrag som manifesterar sig på både individ- och koloninivå. Reproduktiv arbetsfördelning, ett drag som kännetecknar de mest avancerade grupperna av sociala insekter, involverar ofta kastsystem som består av flera beteendemässigt och ofta morfologiskt distinkta grupper. Sådan beteendemässig och morfologisk mångfald mellan kaster styrs inte bara av deras genetiska system utan också ofta av miljön 1,2,3,4, vilket gör eusociala insekter attraktiva ämnen för genetisk och epigenetisk forskning.
Förmågan att manipulera det genetiska systemet hos eusociala insekter har visat sig vara utmanande eftersom många arter inte parar sig och reproducerar sig i laboratoriemiljöer. De flesta eusociala insekter har också mycket få reproduktiva individer i en koloni, vilket begränsar antalet avkommor som kan produceras och följaktligen begränsar provstorleken för genetisk manipulation5. Dessutom har många eusociala insekter långa generationstider jämfört med insekter som vanligtvis används för genetiska studier (som Drosophila), vilket ökar svårigheten att etablera genetiska linjer5. Vissa eusociala arter kan dock generera en stor andel reproduktivt aktiva individer i en koloni, vilket lindrar utmaningarna och ger möjligheter att etablera mutanta eller transgena linjer.
När det gäller ponerinmyrarten, Harpegnathos saltator, kan alla kvinnliga arbetare bli reproduktivt aktiva vid en drottnings död eller social isolering. Dessa arbetare kallas “gamergates” och kan användas för att generera nya kolonier6. Dessutom kan det finnas mer än en gamergate närvarande i en koloni, vilket ökar avkommaproduktionen 5,7,8. Hittills har muterade och/eller transgena linjer utvecklats i det europeiska honungsbiet, Apis mellifera, och hos myrarterna H. saltator, Ooceraea biroi och Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiska analyser hos sociala bin och myror har banat väg för en bättre förståelse av eusocialitet, vilket ger en rad möjligheter att studera gener och deras inverkan på eusocialt insektsbeteende och kastspecifik fysiologi.
Här tillhandahåller vi ett protokoll för genmodifiering via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Specifikt användes denna teknik för att generera en bakteriemutation i orco, genen som kodar för den obligatoriska samreceptorn för alla luktreceptorer (OR)10. OR-gener har utvidgats anmärkningsvärt i hymenopteran eusociala insekter16, och orco spelar en viktig roll i insektslukt; I avsaknad av detta monteras eller fungerar inte de yttersta randområdena normalt. Mutationer av orco-genen stör därför luktkänsla, neural utveckling och associerade sociala beteenden 9,10.
I detta protokoll införs Cas9-proteiner och små guide-RNA (sgRNA) i myrembryon med användning av mikroinjektion i syfte att inducera mutagenes av en målgen. Här kommer vi att beskriva mikroinjektionsproceduren i detalj tillsammans med anvisningar om vård av kolonier och injicerade embryon. Dessa metoder är lämpliga för att inducera mutagenes i en mängd olika gener i H. saltatormyror och kan tillämpas på ett bredare spektrum av hymenopteraninsekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av eusocialitet bland insekter, inklusive myror, bin, getingar och termiter, har resulterat i uppkomsten av nya beteendemässiga och morfologiska egenskaper, av vilka många förstås påverkas av en kombination av miljömässiga och genetiska faktorer 1,2,3,4. Tyvärr har eusociala insekters attraktivitet och användbarhet som forskningsmodeller inom genetikområdet hindrats av sv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Danny Reinbergs och Claude Desplans laboratorier vid New York University och Jürgen Liebigs laboratorium vid Arizona State University för deras stöd för myrgenetik. Hua Yan erkänner stöd från National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under bidrag nr IIP-1821914 och av industripartners. Maya Saar stöddes av United States – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
