고형암의 병리학적 진행을 재구성하기 위한 3D 세포 인쇄 저산소암-온-어칩
Summary
저산소증은 종양 미세 환경의 특징이며 암 진행에 중요한 역할을합니다. 이 문서에서는 3D 세포 인쇄 기술을 기반으로 저산소 암 온 어 칩의 제조 과정을 설명하여 저산소증 관련 암 병리학을 재구성합니다.
Abstract
암 미세 환경은 질병의 진행에 중요한 영향을 미칩니다. 특히 저산소증은 암 생존, 침략 및 화학 저항의 핵심 동인입니다. 저산소증 관련 암 병리학을 연구하기 위해 여러 체외 모델이 개발되었지만, 생체 내에서 관찰된 암 미세 환경의 복잡한 상호 작용은 정확한 공간 제어의 부족으로 인해 아직 재현되지 않았습니다. 대신, 3D 생체 제조 접근법은 암 생태학의 더 나은 에뮬레이션및 정확한 항암 치료 평가를 위한 미생물 계통을 만들기 위하여 제안되었습니다. 본원에서, 우리는 저산소암을 제조하기 위하여 3D 세포 인쇄 접근을 제안합니다- 에-a-칩. 칩내저산소유도 성분은 산소 분포의 컴퓨터 시뮬레이션에 기초하여 결정되었다. 암-스트로마 동심링은 교모세포종 세포와 내피 세포를 포함하는 바이오 잉크를 사용하여 인쇄하여 고형암의 유형을 재구성하였다. 결과 칩은 대표적인 병리학 적 마커의 형성과 암에 중앙 저산소증과 악화 악성 을 실현. 전반적으로, 고체 암-미량 미생물 계통을 만들기 위한 제안된 접근은 암 연구를 위한 생체 내 및 체외 모델 사이 격차를 해소할 것으로 예상됩니다.
Introduction
암 미세 환경은 암 진행을 이끄는 중요한 요소입니다. 생화학, 생물리, 세포 단서를 포함한 여러 구성 요소는 암의 병리학적 특징을 결정합니다. 이들 중 저산소증은 암 생존, 증식 및 침입 1과 밀접한 관련이있다. 암세포의 무한한 성장과 분열로 인해 영양소와 산소가 지속적으로 고갈되고 저산소 그라데이션이 생성됩니다. 낮은 산소 조건에서, 세포는 저산소증 유도할 수 없는 전사 인자 (HIF)-관련 분자 캐스케이드를 활성화합니다. 이 과정은 괴사 코어를 유도하고, 신진 대사 변화를 유발하며, 혈관 증식 및 전이2,3을개시한다. 그 후, 암세포에 있는 저산소증은 이웃한 정상 조직의 파괴를 일으키는 원인이 됩니다. 더욱이, 저산소증은 다인성 매너에서 고형 종양의 치료 저항과 강하게 연관된다. 저산소증은 반응성 산소 종1,4로인해 방사선 반응이 제한되기 때문에 방사선 요법을 심각하게 방해할 수 있다. 또한, 약물 축적을 감소시키는 암 미세환경의 pH 수준을 감소시키는1. 따라서, 체외에서 저산소증과 관련된 병리학적 특징을 재현하는 것은 과학적 및 전임상 연구 결과를 위한 유망한 전략입니다.
암의 특정 미세 환경을 모델링하는 것은 암 발달을 이해하고 적절한 치료를 탐구하는 데 필수적입니다. 동물 모델은 강한 생리적 관련성 때문에 널리 사용되었지만 종 차이 및 윤리적 문제와 관련된 문제는5. 더욱이, 기존의 2D 및 3D 모델은 심층 분석을 위해 암세포의 조작 및 실시간 이미징을 허용하지만, 그들의 건축 및 세포 복잡성은 완전히 재구성될 수 없다. 예를 들어, 암 스페로이드 모델은 스페로이드에서 암세포 응집이 코어에서 저산소증을 자연적으로 생성할 수 있기 때문에 널리 사용되고 있다. 더욱이, 균일한 크기의 셀룰러 스페로이드의 다수는 플라스틱 또는 실리콘 기반 멀티웰 시스템을 사용하여 생산되었다6,7. 그러나, 종래의 플랫폼을 통해 암 조직의 정확한 이질적 구조를 포착하는 것과 관련하여 유연성이 낮을수록 암 연구를 개선하기 위한 고생물학적 플랫폼을 구축하기 위한 첨단 생체 제조 기술의 확립이 요구되고있다 8.
3D 미생물학적 시스템(MPS)은 암세포9의복잡한 기하학적 및 병리학적 진행을 재구성하는 유용한 도구이다. 암세포가 생화학적 그라데이션을 감지함에 따라 성장인자와 케모키인의 생화학적 그라데이션과 시스템에서 재현된 기계적 이질성, 암 발달의 중요한 특징은 시험관내에서 조사될 수 있다. 예를 들어, 암 생존가능성, 전이성 악성, 및 다양한 산소 농도에 따른 약물 내성은 MPSS10,11을사용하여 연구되고 있다. 최근의 발전에도 불구하고, 체외 모델의 저산소 조건을 생성하는 것은 물리적 가스 펌프와의 연결을 포함하여 복잡한 제조 절차에 의존합니다. 따라서 암별 마이크로 환경을 구축하는 간단하고 유연한 방법이 필요합니다.
3D 세포 인쇄 기술은 토착 생물학적 구조를 재구성하기 위해 생체 재료의 공간 적 배치를 정밀하게 제어하여 상당한 주목을 받고있다(12) 특히, 이 기술은 암 미세 환경의 공간 적 특징을 구축하기 위한 높은 제어력과 타당성으로 인해 3D 저산소증 모델의 기존 한계를 극복한다. 또한 3D 프린팅은 층별 공정을 통해 컴퓨터 지원 제조를 용이하게 하여 실제 조직 아키텍처를 모방하기 위해 복잡한 형상을 신속하고 정확하며 재현 가능한 시공을 제공합니다. 3D MPS에 대한 기존 제조 전략의 장점 외에도, 암 진행의 병리학적 특징은 생화학적, 세포 및 생물물리학성분(13,14)을패턴화하여 재현될 수 있다.
본 명세서에서, 고형암의 이질성을 회수하기 위한 저산소암-온-어칩을 위한 3D 세포 인쇄 전략을 제시한다(도1)15. 제조 파라미터는 시스템의 중앙 저산소형성의 전산 시뮬레이션을 통해 결정되었다. 암-스트로마 동심링은 교모세포종 세포와 내피세포를 함유한 콜라겐 바이오잉크를 사용하여 인쇄하여 고형암의 일종인 교모세포종의 병리생리학을 모방하였다. 방사형 산소 그라데이션의 형성은 강화 된 공격성을 나타내는 암 악성 종양을 악화시켰다. 또한, 당사는 환자 별 전임상 모델에 칩의 적용에 대한 미래의 관점을 나타냅니다. 고체 암-미량 미생물 시스템을 만들기 위한 제안된 접근법은 암의 생체 내 및 체외 모델 사이의 격차를 해소할 것으로 예상된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 3D 세포 인쇄 기술을 기반으로 하는 저산소암 온어칩의 제조 과정을 설명합니다. 설계 된 칩의 저산소 그라데이션의 형성은 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 예측되었다. 이질저산소그라데이션을 유도할 수 있는 환경은 3D 프릭 가스 투과성 장벽과 유리 커버를 결합한 간단한 전략을 통해 재현되었다. 암 줄기 세포의 의사 팔래산염 및 작은 인구를 포함하여 교모 세포종의 저산소 관련 병?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 교육부(2020R1A6A1A03047902호) 및 NRF-2018H1A2A1062091호와 한국정부(MSIT)가 지원하는 한국국가연구재단(NRF)의 지원을 받았다. NRF-2019R1C1C1009606 및 NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
References
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