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Abstract
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면역학 및 감염병학

Muestreo y procesamiento del cepillado nasal mediante videomicroscopía ciliar digital de alta velocidad: adaptación para la pandemia de COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Para garantizar un análisis funcional ciliar exitoso y de alta calidad para el diagnóstico de PCD, es esencial un método preciso y cuidadoso para el muestreo y procesamiento del epitelio respiratorio. Para continuar brindando el servicio de diagnóstico de PCD durante la pandemia de COVID-19, el protocolo de videomicroscopía ciliar se ha actualizado para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Abstract

La discinesia ciliar primaria (DCP) es una ciliopatía móvil genética, que conduce a una enfermedad otosinopulmonar significativa. El diagnóstico de PCD a menudo se pasa por alto o se retrasa debido a los desafíos con diferentes modalidades de diagnóstico. La videomicroscopía ciliar, que utiliza videomicroscopía digital de alta velocidad (DHSV), una de las herramientas de diagnóstico para PCD, se considera el método óptimo para realizar el análisis funcional ciliar (CFA), que comprende la frecuencia de latido ciliar (CBF) y el análisis de patrón de latido (CBP). Sin embargo, DHSV carece de un procedimiento operativo estandarizado y publicado para procesar y analizar muestras. También utiliza epitelio respiratorio vivo, un importante problema de control de infecciones durante la pandemia de COVID-19. Para continuar brindando un servicio de diagnóstico durante esta crisis sanitaria, se ha adaptado el protocolo de videomicroscopía ciliar para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Aquí, describimos un protocolo revisado para el muestreo y el procesamiento de laboratorio de muestras respiratorias ciliadas, destacando las adaptaciones realizadas para cumplir con las medidas de control de infecciones por COVID-19. Se describen los resultados representativos de CFA de muestras de cepillado nasal obtenidas de 16 sujetos sanos, procesadas y analizadas de acuerdo con este protocolo. También ilustramos la importancia de obtener y procesar tiras ciliadas epiteliales de calidad óptima, ya que las muestras que no cumplen con los criterios de selección de calidad ahora permiten CFA, lo que podría disminuir la confiabilidad diagnóstica y la eficiencia de esta técnica.

Introduction

La discinesia ciliar primaria (DCP) es una ciliopatía móvil heterogénea hereditaria, en la que los cilios respiratorios son estacionarios, lentos o discinéticos, lo que lleva a un aclaramiento mucociliar alterado y a una enfermedad oto-sino-pulmonar crónica 1,2,3,4. Las manifestaciones clínicas de la DCP son tos húmeda crónica y congestión nasal crónica a partir de la primera infancia, infecciones recurrentes o crónicas del tracto respiratorio superior e inferior que conducen a bronquiectasias, otitis media recurrente o crónica y sinusitis 5,6,7. Aproximadamente la mitad de los pacientes con DCP presentan defectos de lateralidad orgánica como situs inversus o situs ambiguus. Algunos pacientes también presentan problemas de infertilidad debido a espermatozoides inmóviles en hombres y cilios inmóviles en las trompas de Falopio en mujeres 1,2,8. La DCP es rara, pero la prevalencia es difícil de definir, y oscila entre 1:10.000 y 1:20.000 9,10. Sin embargo, se cree que la prevalencia real de DCP es mayor debido a las dificultades en el diagnóstico y la falta de sospecha clínica. Los síntomas de la DCP imitan las manifestaciones respiratorias comunes de otras afecciones respiratorias agudas o crónicas, y los desafíos diagnósticos para confirmar el diagnóstico son bien conocidos, lo que lleva a un tratamiento y seguimiento inadecuados 2,5,9,11.

La videomicroscopía ciliar, que utiliza videomicroscopía digital de alta velocidad (DHSV), es una de las herramientas de diagnóstico para PCD 4,8,12,13. La DHSV se considera el método óptimo para realizar el análisis funcional ciliar (CFA), que comprende el análisis de frecuencia de latido ciliar (CBF) y patrón de latido (CBP) 2,14,15,16. DHSV utiliza epitelio respiratorio vivo, generalmente obtenido del cepillado nasal13.

En vista del brote actual de COVID-19, la confirmación de un diagnóstico de PCD es ahora aún más importante, ya que la evidencia sugiere que la enfermedad respiratoria subyacente puede conducir a peores resultados después de la infección por COVID-1917,18. Un servicio de diagnóstico de PCD seguro y eficiente durante la pandemia actual también permitirá que los pacientes confirmados con PCD se beneficien de medidas de protección adicionales, en comparación con la población general19.

La transmisión de COVID-19 ocurre principalmente a través de la propagación de gotitas20. El alto potencial de transmisión de pacientes asintomáticos (o mínimamente sintomáticos) es sugerido por la alta carga viral en la muestra de nariz20. Además, si las partículas virales se aerosolizan, permanecen en el aire durante al menos 3 horas21. Por lo tanto, los trabajadores de la salud respiratoria están expuestos a un alto reservorio de carga viral mientras realizan la atención clínica y la recolección de muestras para las técnicas de diagnóstico22. Además, la manipulación de muestras respiratorias vivas expone al técnico a la contaminación por COVID-19. Si bien se están implementando recomendaciones de mejores prácticas para médicos respiratorios y cirujanos otorrinolaringólogos que atienden a pacientes con COVID-1923, faltan recomendaciones para realizar DHSV durante la pandemia de COVID-19.

Para continuar brindando un servicio de diagnóstico de PCD, al tiempo que se garantiza la seguridad del trabajador de la salud (que realiza la recolección de muestras) y del técnico (que realiza el procesamiento de muestras), el protocolo de videomicroscopía ciliar tuvo que adaptarse durante la pandemia de COVID-19. La técnica de videomicroscopía ciliar se limita actualmente al servicio de investigación y centros de diagnóstico especializados, ya que la CFA requiere una amplia formación y experiencia. Además, actualmente, existe una falta de estandarización y un procedimiento operativo preciso para procesar y analizar muestras utilizando DHSV 4,13.

El objetivo de este artículo es describir los procedimientos operativos estándar para DHSV, con especial referencia a las medidas de control de infecciones y la seguridad al muestrear y procesar epitelio nasal vivo. Esto permitirá que el diagnóstico y la atención de PCD de alta calidad continúen, a pesar del brote actual de COVID-19.

Protocol

Se obtuvo la aprobación del comité de ética del hospital de Lieja y del Departamento de Higiene y Protección de la Salud en el Trabajo de la Universidad. 1. Muestreo de epitelio ciliado respiratorio Asegúrese de que los sujetos estén libres de infección durante al menos 4-6 semanas, y libres de medicamentos nasales e inhalados, antes de la toma de muestras. Preparar la preparación suplementada de M199: Suplemento medio de cultivo celular 199 (M199) (500 ml) con solu…

Representative Results

Para ilustrar la eficacia de la técnica, presentamos los resultados de la CFA en una serie de 16 voluntarios adultos sanos (5 varones, rango de edad 22-54 años). Las muestras de cepillado nasal de 14 (4 hombres, rango de edad 24-54 años) del total de 16 voluntarios proporcionaron suficientes bordes epiteliales apropiados que cumplieron con los criterios de selección necesarios para realizar CFA. De estas 14 muestras de cepillado nasal, se registraron un total de 242 bordes ciliados, y 212 …

Discussion

Este documento tiene como objetivo proporcionar un procedimiento operativo estándar para CFA utilizando muestras de cepillado nasal, con ajustes realizados para las consideraciones apropiadas de control de infecciones durante la pandemia de COVID-19. El diagnóstico de PCD es desafiante, y actualmente requiere un panel de diferentes pruebas de diagnóstico, de acuerdo con la recomendación internacional, incluida la medición nasal de óxido nítrico, CFA usando DHSV, análisis ultraestructural ciliar usando microscopí…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier y a todos los miembros del equipo del centro de diagnóstico PCD de Paris-Est por su disponibilidad y cordial bienvenida durante la visita a su centro de diagnóstico PCD, y los numerosos intercambios. También agradecemos a Robert Hirst y a todos los miembros del equipo en el centro PCD de Leicester por su bienvenida y tiempo, asesoramiento y experiencia.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
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References

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Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
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