Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico
Summary
Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.
Abstract
Recientemente se ha informado en la literatura que los heterociclos espirocíclicos son fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer. La síntesis de estos novedosos sistemas de anillos ortogonales es un desafío. Recientemente se publicó una metodología eficiente para sintetizar estos compuestos que describía la síntesis en fase sólida en cuatro pasos en lugar de los cinco pasos previamente informados. La ventaja de esta síntesis más corta es la eliminación del uso de reactivos tóxicos. Se descubrió que la resina basada en enlazadores de baja carga Regenerating Michael (REM) era crucial en la síntesis, ya que las versiones de alta carga evitaban la adición de reactivos que contenían cadenas laterales voluminosas de fenilo y aromáticas. El ensayo colorimétrico de bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para examinar la citotoxicidad de las concentraciones micromolares de estas nuevas moléculas espirocíclicas in vitro. MTT está fácilmente disponible comercialmente y produce resultados relativamente rápidos y confiables, lo que hace que este ensayo sea ideal para estos heterociclos espirocíclicos. Se probaron estructuras de anillos ortogonales, así como furfurilamina (un precursor en el método de síntesis que contiene un motivo de anillo similar de 5 miembros).
Introduction
Se sabe que la inhibición de moléculas pequeñas de la interacción del homólogo de doble minuto 2 del ratón ubiquitina-ligasa E3 (MDM2) con p53 restaura la inducción mediada por p53 de la apoptosis de células tumorales 1,2,3. MDM2 es un regulador negativo de la vía p53 y a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas 4,5,6,7,8,9. Estudios cristalográficos y bioquímicos recientes han revelado que moléculas pequeñas que contienen un marco espirocíclico pueden inhibir eficazmente las interacciones MDM2-p5310. El marco espirocíclico (Figura 1, sombreado en azul) se considera un motivo privilegiado ya que la derivatización de este sistema de anillos ortogonales rígidos ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos terapéuticos. Acceder a esta interesante arquitectura plantea un desafío cuando se utilizan técnicas tradicionales de síntesis orgánica. Aunque se han investigado los efectos terapéuticos de las moléculas espirocíclicas en los sistemas biológicos, la síntesis de estas moléculas sigue siendo un proceso engorroso. Los productos secundarios no deseados, el uso de condiciones adversas y los metales de transición peligrosos a menudo son problemáticos.
El uso potencial del motivo espirocíclico en el desarrollo de fármacos condujo al desarrollo de un protocolo que utiliza la síntesis en fase sólida para generar una biblioteca de moléculas con el motivo además de otros grupos funcionales intercambiables11,12. La separación de productos y reactivos entre los pasos podría lograrse simplemente utilizando un enlazador REM conectado a un cordón de resina y un recipiente de filtro de fase sólida. Esto reduciría los escalones y potencialmente aumentaría los rendimientos. Este enfoque sintético podría producir una gran variedad de posibles candidatos a fármacos. Sin embargo, la efectividad de estas moléculas en un sistema biológico requeriría más investigación.
Para determinar la citotoxicidad de estos compuestos espirocíclicos, se empleó el ensayo MTT13,14. Este método mide la viabilidad celular y se puede utilizar para determinar indirectamente la citotoxicidad celular. Se agregaron diferentes concentraciones de los inhibidores a las células cultivadas en una placa de 96 pocillos, y la proporción de células vivas se midió mediante análisis colorimétrico del grado de reducción de MTT amarillo por deshidrogenasas mitocondriales al compuesto formazán púrpura (Figura 2). La actividad se informa con mayor frecuencia como un valor IC 50, la concentración en la que el crecimiento celular se inhibe en un50% en relación con un control no tratado. Este artículo describe el protocolo para el ensayo MTT y los resultados preliminares de estas nuevas moléculas espirocíclicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La síntesis de los compuestos espirocíclicos se basó en investigaciones previas realizadas por este laboratorio, pero con algunas modificaciones (Figura 1)11,12. El progreso de cada paso de reacción fue monitoreado por espectroscopia IR. La adición de Michael del enlazador REM 1 con furfurilamina proporcionó 2 unido al polímero (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de la Facultad a K.S.H. (Oficina de Investigación y Subvenciones, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. y J.F.M. son beneficiarios de la beca Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. y B.M.R. son beneficiarios de las becas de investigación STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Agradecemos al Dr. Matthew Berezuk y al Dr. Philip Cox por su orientación sobre los bioensayos.
Materials
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
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