我们提供一个详细的协议,电穿孔中化RNA干扰昆虫的顺序奥多纳塔(龙和水坝自体)使用蓝尾大坝自己(伊施努拉塞内加尔:科埃纳吉罗尼达:Zygoptera)和皮鱼掠食(伪themis zonata:利贝鲁利达:阿诗兰图。
苍蝇和水坝(Order Odonata)是最具进化的祖传昆虫之一,它们从水生幼虫到没有幼崽阶段的陆生/空中成年人,急剧改变其栖息地、形态和行为。Odonata 成人拥有发达的色彩视觉,在性别、阶段和物种上表现出显著的身体颜色和图案多样性。虽然对奥多纳塔进行了许多生态学和行为学研究,但分子遗传学研究很少,主要是因为难以将基因功能分析应用于奥多纳塔。例如,如《利皮多普特拉》中所报道的,RNA干扰(RNAi)在奥多纳塔效果较低。为了克服这个问题,我们成功地建立了一种与体内电穿孔相结合的RNAi方法。在这里,我们提供详细的协议,包括电穿孔调解RNAi方法的视频,如下所示:幼虫的制备、物种鉴定、dsRNA/siRNA溶液和注射针的制备、幼虫的冰冷麻醉、dsRNA/siRNA注射、体内电穿孔和个体饲养直至成人出现。电穿孔中占RNAi方法适用于大坝自体(子顺序Zygoptera)和蛾(次顺序 Anisoptera)。在该协议中,我们提出了蓝尾水坝自我伊施努拉 塞内加尔 (Coenagrionidae)的方法,作为水坝物种和鱼皮掠食者伪特米斯佐 纳塔( 利贝勒利达)作为另一个例子的食虫物种。作为代表性的例子,我们显示了RNAi靶向黑色素合成基因 多分子氧化酶2的结果。此RNAi方法将有助于理解与奥多纳塔的变质、形态生成、颜色模式形成和其他生物特征有关的各种基因功能。此外,此协议一般适用于非模型生物体,其中RNAi由于效率低下和低切青素而在基因抑制方面效果较低。
龙和水坝(秩序奥多纳塔)是最祖传的昆虫群体,表现出”变形“1,2。通过变质,它们改变其栖息地,形态和行为急剧从水生幼虫到陆生/空中成人3。Odonata成人有一个发达的颜色视觉,代表了身体颜色和图案跨越性别,阶段和物种3,4,5的显著多样性。虽然对奥多纳塔进行了6、7项生态和行为研究,但分子遗传学研究主要由于难以将基因功能分析应用于奥多纳塔而受阻。
传统的RNA干扰(RNAi)方法,其中双链RNA(dsRNA)被注射,以抑制感兴趣的基因8的功能,结果在奥多纳塔昆虫9无效,如在Lepidopteran昆虫10报告。另一方面,以前的报告已经表明,电穿孔调制的RNAi在利皮多普坦物种中是有效的,特别是在表皮组织11、12、13。我们最近发现,电穿孔的RNAi在微小的南诺菲亚(利贝鲁利达:阿尼索普泰拉)9中有效工作,但N.pygmaea是一个相对罕见的物种,因此不适合分子遗传学研究。
大多数奥多纳塔物种被分为两个子顺序之一,Zygoptera(水坝)或安尼索普特拉(真正的蛾)3。在这里,我们重点介绍了蓝尾水坝的伊施努拉·塞内森西斯(科纳格里尼达;图1A)作为代表的齐戈普坦物种和皮鱼食龙伪特米斯佐纳塔(利贝鲁利达;图1B)作为一个代表的阿尼索普坦物种。这两种物种是日本自然和城市池塘中最常见的奥多纳塔物种之一,包括筑波市的物种,我们可以在野外采集两种物种的许多幼虫。最近,我们建立了一个实验室饲养系统,为个体幼虫的E.塞内加尔,使持续监测的发展,并在莫多纳塔幼虫的形态发生详细14。
在这份报告中,我们为 I.塞内加尔 和P.Zonata的电穿孔调解RNAi提供了一个 精细的方法和视频协议。在日本 ,I. 塞内加尔和 伊施 努拉亚洲,这是基因接近,往往发现共生15,他们很难区分在幼虫16。我们还描述了如何通过限制片段长度多态性 (RFLP) 来区分两个 Ischnura 物种。
为了评估电穿孔介质RNAi的有效性,我们选择多可可氧化酶2基因(MCO2;也称为laccase2)作为代表性靶基因,因为基因表达9被击倒时,具有明显的表型。众所周知,MCO2对于各种昆虫物种17、18的表皮变暗至关重要。
RNAi 治疗的致命性
我们发现,RNAi治疗的致命性在很大程度上取决于奥多纳塔幼虫的饲养史和状况。在田间采集后不久,幼虫普遍健康,电穿孔调制RNAi治疗后死亡率较低。相比之下,在实验室中长期饲养的幼虫(例如一个月)往往成年的成功率很低。 在I.塞内加尔,而不是在野外收集的幼虫,在实验室中从卵子中饲养的幼虫可以使用14,但RNAi使用实验室饲养的幼虫的成功率往往比使用田间收集的幼虫低得多(许多人在变质过程中死亡)。此外,频繁的幼虫喂养和清洁水养殖对于提高成人的成功率和降低RNAi治疗的致命性非常重要。
RNAi 治疗效率
如上所述,RNAi表型的水平,即角质层脱色的大小和位置,在接受相同RNAi治疗的个体之间经常表现出相当大的差异(例如,图4),但表皮切入水平似乎在奥多纳塔物种之间明显不同。观察到的表型区域在I. 塞内加尔(图4-5)中比在 P. zonata (图6)和N. pygmaea9 中更大、更突出。这种差异可能是由于幼虫表面的角质层厚度,考虑到 I. 塞内加尔的角质层比P. zonata 和 N. pygmaea 的角质层更薄。据我们研究,siRNA和dsRNA的影响之间没有明显差异(图4,表1)。
RNAi 的适当发展阶段
应该注意的是,适当的幼虫分期对于有效执行RNAi非常重要。抑制成人色素沉着是由MCO2 RNAi在D阶段(约3天前成人出现前)引起的,这与上一次关于N.pygmaea9的报告一致。在C和D阶段注射时观察到的RNAi表型不如在A和B阶段治疗的表型明显,这表明C和D阶段可能为时已晚,不足以抑制基因表达。RNAi治疗的适当时机取决于基因表达的时间,MCO2基因在成人出现9期间表现出短暂的高表达,就像其他昆虫17、18一样。在臭虫普劳蒂亚斯塔利,RNAi敲掉MCO2基因从第4天开始注射27后,这是符合目前的结果。
我们先前对一体的研究表明,在B阶段之后,从天到成人出现的大多数最终星体幼虫之间表现出相对较小的变化,这表明B阶段可能与成人出现过程的开始相对应,之后,变质的发育过程以前缀和协调的方式进行14。当幼虫在C和D阶段进行RNAI治疗时,经常观察到伤口引起的形态异常(图7B,7C)。 这可能与这些阶段的变质的戏剧性进展有关,这表明应避免从阶段C和上阶段RNAi治疗。总之,我们建议在阶段 A 或 B(或在幼虫翅膀显著扩张之前)的最终星幼虫应用于 RNAi 实验。
电穿孔介质RNAi方法的有用性和优越性
传统的RNAi是一种简单而有力的实验方法,但一些昆虫谱谱,如蝴蝶10、甲虫28和9,表现出较低的RNAi效率,为此建立基因功能分析是一个重大挑战。在这项研究中,我们发现电穿孔的RNAi可以诱导局部基因抑制在蛾,几乎100%的效率,至少在表皮,如果在适当的发育阶段治疗(表1)。最近,基于CRISPR/Cas9的基因敲除已成功应用于各种昆虫,为非模型生物体29提供了强大的分子遗传工具。然而,在这里,我们指出,CRISPR/Cas9当然是伟大的,但电穿孔调解RNAi方法可能优于CRISPR/Cas9在某些方面。
首先,在电穿孔介质RNAi方法中,RNAi表型出现的身体区域可以通过电穿孔时正极的位置进行实验控制。此外,由于基因表达被抑制的区域在正极放置区域周围受到限制,RNAi 表型可以很容易地与同一个体中并排的对照表型进行比较。其次,与CRISPR/Cas9方法相比,注射的卵子必须饲养到成年才能观察到敲除表型,电穿孔调置的RNAi是优越的,因为通常可以在更短的时间内观察到基因敲除表型。例如,I.塞内加尔人需要三到四个月,从卵子到14,30岁的成年人需要一到两年的时间。然而,为了观察成人表皮中的RNAi表型,从dsRNA注射到B阶段最后一次的星体幼虫,到成人出现,需要不到一个月的时间(图7)。第三,电穿孔中显的RNAi方法需要将dsRNA注射到大幼虫中,这比微注射到CRISPR/Cas9方法所需的小鸡蛋中要容易得多。此外,电穿孔的RNAi适用于新产卵难以收集的昆虫物种。例如,P.Zonata的雌性在飞行过程中在水面上的漂浮植物上产卵,因此很难在野外和实验室中采集卵子。因此,我们预计,该协议可能一般适用于传统RNAi方法不能有效工作的非模型生物体。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢森山先生的技术建议和支持,滨弘田和铃木瑞太郎收集奥多纳塔幼虫,和米沙信雅对手稿的有益评论。这项工作得到了JSPS KAKENHI授权号码JP18J21561到G和JP18H02491,JP18H04893,JP19H03287和JP20H04936到RF的支持。
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |