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의학

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/61957
, , , , ,
1Experimental Ophthalmology,University of Geneva, 2Department of Ophthalmology,University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。

Abstract

酸化ストレスは、加齢黄斑変性症(AMD)を含むいくつかの変性疾患において重要な役割を果たします。網膜色素上皮(RPE)合成神経保護因子の減少、例えば、色素上皮由来因子(PEDF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、RPE細胞の喪失、そして最終的には光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死につながる。我々は、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するトランスフェクションRPE細胞の遺伝子導入による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を緩和し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性があると仮定する。眠れる森の美しさトランスポゾンシステム(SB100X)を用いて、ヒトRPE細胞はPEDFおよびGM-CSF遺伝子にトランスフェクトされ、qPCR、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫蛍光を用いた安定した遺伝子集積、長期遺伝子発現、タンパク質分泌を示した。トランスフェクトされたRPE細胞によって分泌されるPEDFおよびGM-CSFの機能性と効力を確認するために、培養中のRPE細胞に対するH2O2誘導酸化ストレスの低減を定量化するインビトロアッセイを開発しました。細胞保護は、細胞の形態、密度、グルタチオンの細胞内レベル、UCP2遺伝子発現、および細胞生存率を分析することによって評価した。いずれも、トランスフェクトされたRPE細胞は、非トランスフェクトされたPEDFおよびGM-CSFおよび未導入の細胞および未導入の細胞(市販または遺伝子組み換え細胞から精製された)で前処理された細胞は、非治療対照と比較して有意な抗酸化細胞保護を示した。本H2O2-modelは、AMDまたは類似の神経変性疾患を治療するのに有効であり得る因子の抗酸化効果を評価するための簡便かつ有効なアプローチである。

Introduction

ここで説明するモデルは、細胞内の酸化ストレスを低減するためのバイオ医薬品の効率を評価するのに有用なアプローチを提供する。このモデルを用いて、高レベルのO2に曝露される網膜色素上皮細胞に対するH2O2-媒介酸化ストレス、可視光、光受容体外皮膜の貪食作用、活性酸素種(ROS)1に対する保護効果を調べた。 2.彼らは血管の加齢黄斑変性症(aAMD)3、4、5、6、7、8の病因に大きく貢献していると考えられている。また、RPE合成神経保護因子、特に色素上皮由来因子(PEDF)、インスリン様成長因子(IIF)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)がRPE細胞の機能不全および喪失をもたらし、続いて光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死亡が減少している。.AMDは、代謝、機能、遺伝的、および環境因子4間の相互作用から生じる複雑な疾患である。aAMDの治療の欠如は、先進国9,10の60歳以上の患者における失明の主な原因である。PEDFおよびGM-CSFを過剰発現する遺伝子組み換えRPE細胞の遺伝子組み換え後移植による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を軽減し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性を秘めている11、12、13、14、15、16.細胞に遺伝子を送達するいくつかの方法論があるにもかかわらず、我々は、その安全性プロファイル、宿主細胞のゲノムへの遺伝子の統合、および以前に示したように非転写活性部位に提供された遺伝子を統合する傾向のために、PEDFおよびGM-CSF遺伝子をRPE細胞に送達する非ウイルス性多動性睡眠美容トランスポゾンシステムを選択した。 18,19.

細胞酸化ストレスは、過酸化水素(H2O2)、4-ヒドロノネナー(HNE)、テルブチルヒドロペルオキシド(tBH)、高酸素張力、可視光(全スペクトルまたはUV照射)20、21を含む、いくつかの酸化剤によってインビトロで培養された細胞において誘導され得る。高い酸素の緊張およびライトは他のシステムへの移動性を制限する特別な装置および条件を要求する。H2O2、HNE、およびtBHなどの薬剤は、分子および細胞変化と重なり合う酸化ストレスを誘発する。我々は、RPE細胞が感光体外セグメント食細胞化22中に活性酸素中間体としてRPE細胞によって産生され、生体23の眼組織に見られるため、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化活性を試験するためにH2O2を選択した。グルタチオンの酸化は、目の中のH2O2の産生に部分的に関与する可能性があるため、我々は、H2O2誘導酸化ストレスおよび細胞21,22の再生能力に関連するGSH/グルタチオンのレベルを分析した。グルタチオンレベルの分析は、眼24における抗酸化保護機構に関与するため、特に関連性が高い。H2O2への曝露は、RPE細胞1、25、26、27、28、29、30、および加えて、酸化ストレスの「生理学的」な刺激源である、酸化ストレスの「生理学的」源であるRPE細胞の酸化ストレス感受性および抗酸化活性を調べるモデルとして頻繁に使用される。

神経保護因子の機能性と有効性を評価するために、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するように遺伝子組み換え細胞によって発現される成長因子の抗酸化効果を定量化する分析を可能にするインビトロモデルを開発した。ここでは、PEDFおよびGM-CSFの遺伝子にトランスフェクトされたRPE細胞は、細胞の形態、密度、生存率、グルタチオンの細胞内レベル、およびミトコンドリア非結合タンパク質2の発現によって証明されるように、非トランスフェクション対照細胞よりもH2O2の有害な影響に対してより耐性があることを示す(ROS1酸素種)。

Protocol

人間の目の収集と使用のための手順は、研究のための教育倫理委員会によって承認されました (no. 2016-01726). 1. 細胞の分離と培養条件 ヒトARPE-19細胞株 ダルベッコの修飾ワシのミディアム/栄養素混合物F-12ハム(DMEM/ハムのF-12)に10%のウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリンを加えた培養5 x 105 ARPE-19細胞、 T75フラスコの加湿雰囲気で37°Cで80μg/mLレンサプレプ…

Representative Results

ヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導ARPE-19および一次hRPE細胞を24時間H2O2の様々な濃度で処理し、抗酸化グルタチオンの細胞内レベルを定量化した(図2A、B)。H2O2は50μMおよび100μMでグルタチオンの産生に影響を与えなかったのに対し、350μMではARPE-19および一次hRPE細胞においてグ?…

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、トランスフェクトされた細胞によって産生されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化および保護機能を分析するアプローチを提供し、これは任意の推定有益な遺伝子をトランスフェクトした細胞に適用することができる。遺伝子組換え細胞を移植してタンパク質を組織に送達することを目的とする遺伝子治療戦略では、タンパク質発現のレベル、発現の長さ、および発現タ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、グレッグ・シーリーとアラン・コンティに優れた技術支援と、ベルリンのマックス・デルブリュック・センターのツズザンナ・イズスヴァーク教授に感謝したいと考えています。この研究は、第7枠組みプログラムの文脈でスイス国立科学財団と欧州委員会によって支援されました。Z.Iは欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]によって資金提供されました。

Materials

24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301
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References

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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).
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