Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco
Summary
Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e l’uso di un modello di stress ossidativo trattando le cellule epiteliali pigmentate retiniche con H2O2, analizzando la morfologia cellulare, la vitalità, la densità, il glutatione e il livello di UCP-2. È un modello utile per studiare l’effetto antiossidante delle proteine secrete dalle cellule trasfettate con trasposone per trattare la degenerazione neuroretinica.
Abstract
Lo stress ossidativo svolge un ruolo fondamentale in diverse malattie degenerative, tra cui la degenerazione maculare legata all’età (AMD), una patologia che colpisce circa 30 milioni di pazienti in tutto il mondo. Porta ad una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati dall’epitelio pigmentato retinico (RPE), ad esempio il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) e il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), seguiti dalla perdita di cellule RPE e infine dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC). Ipotizziamo che la ricostituzione dell’ambiente retinico neuroprotettivo e neurogenico mediante trapianto subretinico di cellule RPE trasfettate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF abbia il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l’infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare. Utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata nel Bosco(SB100X)le cellule RPE umane sono state trasfettate con i geni PEDF e GM-CSF e hanno mostrato un’integrazione genica stabile, un’espressione genica a lungo termine e una secrezione proteica utilizzando qPCR, western blot, ELISA e immunofluorescenza. Per confermare la funzionalità e la potenza del PEDF e del GM-CSF secreti dalle cellule RPE trasfettate, abbiamo sviluppato un test in vitro per quantificare la riduzione dello stress ossidativo indotto da H2O2sulle cellule RPE in coltura. La protezione cellulare è stata valutata analizzando la morfologia cellulare, la densità, il livello intracellulare di glutatione, l’espressione genica UCP2 e la vitalità cellulare. Sia le cellule RPE trasfettate che sovraesprimono PEDF e/o GM-CSF che le cellule non trasfettate ma pretrattate con PEDF e/o GM-CSF (disponibili in commercio o purificate da cellule trasfettate) hanno mostrato una significativa protezione delle cellule antiossidanti rispetto ai controlli non trattati. L’attuale modello H2O2è un approccio semplice ed efficace per valutare l’effetto antiossidante di fattori che possono essere efficaci per il trattamento di AMD o malattie neurodegenerative simili.
Introduction
Il modello qui descritto, offre un approccio utile per valutare l’efficienza degli agenti biofarmaceutici per ridurre lo stress ossidativo nelle cellule. Abbiamo utilizzato il modello per studiare gli effetti protettivi di PEDF e GM-CSF sullo stress ossidativo mediato da H2O2sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche, che sono esposte ad alti livelli di O2e luce visibile, e la fagocitosi delle membrane del segmento esterno dei fotorecettori, generando livelli significativi di specie reattive dell’ossigeno (ROS)1, 2. Sono considerati un importante contributo alla patogenesi della degenerazione maculare avascolare legata all’età (aAMD)3,4,5,6,7,8. Inoltre, vi è una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati RPE, in particolare il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF), i fattori di crescita insulino-simili (IGF) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF) che porta alla disfunzione e alla perdita delle cellule RPE, seguito dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC)3,4,5 . L’AMD è una malattia complessa che deriva dall’interazione tra fattori metabolici, funzionali, genetici e ambientali4. La mancanza di trattamenti per l’aAMD è la principale causa di cecità nei pazienti di età superiore ai 60 anni nei paesiindustrializzati9,10. La ricostituzione dell’ambiente retinico neuroprotettivo e neurogeno mediante trapianto subretinico di cellule RPE geneticamente modificate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF ha il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l’infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare11,12,13,14,15,16 . Anche se ci sono diverse metodologie per fornire geni alle cellule, abbiamo scelto il sistema di trasposoni iperattivi non virali della Bella Addormentata per fornire i geni PEDF e GM-CSF alle cellule RPE a causa del suo profilo di sicurezza, dell’integrazione dei geni nel genoma delle cellule ospiti e della sua propensione a integrare i geni consegnati in siti non trascrizionalmente attivi come abbiamo mostrato in precedenza17, 18,19.
Lo stress ossidativo cellulare può essere indotto in cellule coltivate in vitro da diversi agenti ossidativi, tra cui perossido di idrogeno (H2O2), 4-idronetonale (HNE), terzbutilidroperossido (tBH), alte tensioni di ossigeno e luce visibile (spettro completo o irradiazione UV)20,21. Le elevate tensioni di ossigeno e la luce richiedono attrezzature e condizioni speciali, che limitano la trasferibilità ad altri sistemi. Agenti come H2O2, HNE e tBH inducono cambiamenti molecolari e cellulari da stress ossidativo sovrapposti. Abbiamo scelto H2O2 per testare l’attività antiossidante di PEDF e GM-CSF perché è conveniente e biologicamente rilevante poiché è prodotto dalle cellule RPE come intermedio reattivo dell’ossigeno durante la fagocitosi del segmento esterno dei fotorecettori22 e si trova nei tessuti oculari in vivo23. Poiché l’ossidazione del glutatione può essere parzialmente responsabile della produzione di H2O2 nell’occhio, abbiamo analizzato i livelli di GSH / glutatione nei nostri studi, che sono legati allo stress ossidativo indotto da H2O2e alla capacità rigenerativa delle cellule21,22. L’analisi dei livelli di glutatione è particolarmente rilevante poiché partecipa ai meccanismi protettivi antiossidanti nell’occhio24. L’esposizione a H2O2 è usata frequentemente come modello per esaminare la suscettibilità allo stress ossidativo e l’attività antiossidante dellecellule RPE1,25,26, 27,28, 29,30e, inoltre, mostra somiglianze con il danno da stress ossidativo indotto dalla luce, una fonte “fisiologica” di stress ossidativo21.
Per valutare la funzionalità e l’efficacia dei fattori neuroprotettivi, abbiamo sviluppato un modello in vitro che consente l’analisi per quantificare l’effetto antiossidante dei fattori di crescita espressi da cellule geneticamente modificate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. Qui, mostriamo che le cellule RPE trasfettate con i geni per PEDF e GM-CSF sono più resistenti agli effetti dannosi di H2O2 rispetto alle cellule di controllo non trasfettate, come evidenziato dalla morfologia cellulare, densità, vitalità, livello intracellulare di glutatione ed espressione del gene UCP2, che codifica per la proteina di disaccoppiamento mitocondriale 2 che ha dimostrato di ridurre le specie reattive dell’ossigeno (ROS)31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato offre un approccio per analizzare la funzione antiossidante e protettiva di PEDF e GM-CSF prodotti da cellule trasfettate, che possono essere applicate a cellule trasfettate con qualsiasi gene benefico putativo. Nelle strategie terapeutiche geniche che hanno l’obiettivo di fornire proteine ai tessuti trapiantando cellule geneticamente modificate, è fondamentale ottenere informazioni sul livello di espressione proteica, sulla longevità dell’espressione e sull’efficacia della proteina espress…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Gregg Sealy e Alain Conti per l’eccellente assistenza tecnica e il Prof. Zsuzsanna Izsvák del Max-Delbrück Center di Berlino per aver gentilmente fornito i plasmidi pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera per le scienze e dalla Commissione europea nell’ambito del Settimo programma quadro. Z.I è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].
Materials
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 6-well plates | Greiner | 7657160 | |
| 96-well culture plate white with clear flat bottom | Costar | 3610 | Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay) |
| 96-well plates | Corning | 353072 | |
| Acrylamid 40% | Biorad | 161-0144 | |
| Amphotericin B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| Antibody anti-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM | Agilent | P0260 | |
| Antibody anti-PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| Antibody anti-penta-His | Qiagen | 34660 | |
| Antibody anti-phospho-Akt | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Antibody goat anti-mouse Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 cell line | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| chamber culture glass slides | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Duo Set ELISA kit | R&D Systems | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kit | BioProducts MD | PED613-10-Human | |
| Eyes (human) | Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism software (version 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo Glutathione Assay | Promega | V6912 | |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Merck | 107209 | |
| ImageJ software (image processing program) | W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014 | ||
| Imidazol | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B microscope | Leica Microsystems | ||
| LightCycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 software | Roche Molecular Systems | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
| Nitrocellulose | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Gel Imaging System | Aplegen Life Science | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Primers | Invitrogen | See Table 1 in Supplementary Materials | |
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796. | ||
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
| recombinant hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| recombinant hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA Cell Miniprep System | Promega | Z6011 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase-free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| Semi-dry transfer system for WB | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Urea | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP substrate | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman nitrocellulose membrane | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
References
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