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의학

Fruchtbarkeitserhaltung durch Eizellvitrifikation: Klinische und Laborperspektiven

Published: September 16, 2021
doi:
10.3791/61963
, , , , , , ,
1Clinica Valle Giulia,GeneraLife IVF

Summary

Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt. Geeignete klinische und Laborstrategien gewährleisten maximale Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit von Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlungen.

Abstract

Die Erhaltung der weiblichen Fruchtbarkeit ist in einem multifunktionalen Gesundheitssystem, das sich um die zukünftige Lebensqualität der Patienten kümmert, von entscheidender Bedeutung. Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen. Die wichtigsten medizinischen Indikationen sind onkologische Erkrankungen, gynäkologische Erkrankungen wie schwere Endometriose, systemische Erkrankungen, die die Eierstockreserve beeinträchtigen, und genetische Erkrankungen mit vorzeitiger Menopause. Dieses Papier beschreibt die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung, indem es Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert. Darüber hinaus konzentriert es sich auf die Wirksamkeit des Verfahrens und beschreibt die am besten geeigneten Strategien, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen wurden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben.

Introduction

Die Entwicklung und Implementierung eines effizienten Kryokonservierungsprogramms für menschliche Eizellen war ein bedeutender Durchbruch in der Reproduktionsmedizin. Jüngsten Erkenntnissen zufolge ist die Vitrifikation die effektivste Strategie zur Kryokonservierung von Eizellen der Metaphase II (MII), da sie unabhängig von der Patientenpopulation (unfruchtbare Patientinnen oder Eizellspendeprogramm) zu statistisch höheren Überlebensraten im Vergleich zum langsamen Einfrieren führt1,2,3. Die bemerkenswerten Errungenschaften der Eizellvitrifikation veranlassten die Praxiskomitees der American Society for Reproductive Medicine (ASRM) und der Society for Assisted Reproductive Technology (SART), diese Technik als die effektivste für die elektive Fruchtbarkeitserhaltung bei postpubertären Frauen zu erklären, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen4,5,6. Medizinische Indikationen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit umfassen (i) Krebs und Autoimmunerkrankungen, die Therapien7 wie Strahlentherapie, zytotoxische Chemotherapie und endokrine Therapie erfordern (deren schädliche Wirkung auf die Eierstockreserve mit dem Alter der Mutter sowie art und dosis der Behandlung verbunden ist); ii) Eierstockerkrankungen, die eine wiederholte oder radikale Operation erfordern (z. B. Endometriose)8; und (iii) genetische Erkrankungen (z. B. X-fragile) oder vorzeitiges Ovarialversagen. Darüber hinaus ist die Erhaltung der Fruchtbarkeit zu einer wertvollen Option für alle Frauen geworden, die ihr elterliches Ziel aus nicht-medizinischen Gründen nicht erreicht haben (auch bekannt als Social Freezing).

Unabhängig von der Indikation zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und gemäß den wichtigsten internationalen Richtlinien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sollten alle Patientinnen, die bereit sind, ihre Eizellen zu vitrifizieren, eine angemessene Beratung erhalten, um über ihre realistischen Erfolgschancen, die Kosten, Risiken und Einschränkungen des Verfahrens informiert zu werden9,10,11,12,13. Am wichtigsten ist, dass klar sein sollte, dass die Vitrifizierung einer Kohorte von MII-Eizellen keine Schwangerschaft gewährleistet, sondern dass sie eine höhere Erfolgschance für die zukünftige In-vitro-Fertilisation (IVF) bietet, falls erforderlich14. In dieser Hinsicht ist das Alter der Frau zum Zeitpunkt der Vitrifizierung der Eizellen sicherlich der wichtigste limitierende Faktor15, da das fortgeschrittene mütterliche Alter (AMA; >35 Jahre) die Hauptursache für weibliche Unfruchtbarkeit ist16. Neben einer fortschreitenden Verringerung der Ovarialreserve ist AMA mit einer Beeinträchtigung der Eizellkompetenz aufgrund defekter physiologischer Wege wie Stoffwechsel, epigenetische Regulation, Zellzyklus-Checkpoints und meiotische Segregation verbunden17. Daher hängt die angemessene Anzahl der zu vitrifizierenden Eier hauptsächlich vom Alter der Mutter ab. Bei Frauen unter 36 Jahren sind mindestens 8-10 MII-Eizellen18 erforderlich, um die Erfolgschancen zu maximieren. Im Allgemeinen gilt: Je höher die Anzahl der vitrifizierten Eizellen, desto höher ist die Erfolgswahrscheinlichkeit. Daher ist die Anpassung der ovariellen Stimulation an ovariellen Reservemarkern wie Anti-Müller-Hormon (AMH) oder Antralfollikelzahl (AFC) entscheidend, um die Eierstockreserve in kürzester Zeit voll auszuschöpfen.

Die Sicherheit des gesamten Verfahrens ist das andere Schlüsselthema bei der Aufnahme von Patienten zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Kliniker sollten die besten Strategien anwenden, um die Risiken zu minimieren und (i) das ovarielle Hyperstimulationssyndrom (OHSS) zu verhindern, indem sie sichere Ansätze wie das Gonadotrophin-Releasing-Hormon (GnRH) -Antagonistenprotokoll verwenden, gefolgt von einem GnRH-Agonistenauslöser19 und (ii) den entfernten, aber möglichen Risiken von Peritonealblutungen, Verletzungen der Beckenstrukturen (Harnleiter, Darm, Blinddarm, Nerven) oder Beckeninfektionen während der Eizellentnahme. Schließlich (iii) traditionelle Stimulationsschemata sind mit supraphysiologischem Serumestradiol verbunden und werden daher bei östrogenempfindlichen Erkrankungen wie Brustkrebs nicht empfohlen. Protokolle mit Aromatasehemmern (wie Letrozol oder Tamoxifen) sind in diesen Fällen besser geeignet20,21. Im Labor ist das am weitesten verbreitete Protokoll zur Vitrifikation von Eizellen immer noch das von Kuwayama und Kollegen 2,23beschriebene Protokoll, das auseinemschrittweisen Verfahren besteht, bei dem Kryoprotektoren (CPAs) schrittweise hinzugefügt werden. In der ersten Phase (Gleichgewicht/Dehydratation) werden Eizellen in einer CPA-Lösung exponiert, die 7,5% v/v Ethylenglykol und 7,5% v/v Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält, während in der zweiten Phase Eizellen in eine Vitrifikationslösung mit 15% v/v Ethylenglykol und 15% v/v DMSO plus 0,5 mol/L Saccharose bewegt werden. Nach einer kurzen Inkubation im Medium der Vitrifikation können die Eizellen in speziell entwickelte, offene Kryodevices gelegt und schließlich bei -196 °C in flüssigen Stickstoff getaucht werden, um bis zur Verwendung gelagert zu werden.

Hier wurde die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung beschrieben, indem (i) Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert wurden, (ii) die Kosteneffizienz des Verfahrens im Mittelpunkt stand und (iii) die am besten geeigneten Strategien beschrieben wurden, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen werden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben. Da andere Protokolle oder Anpassungen dieses Protokolls in der Literatur existieren, gelten die repräsentativen Ergebnisse und die Diskussionsabschnitte dieses Manuskripts nur für dieses Verfahren.

Protocol

1. Aufarbeitung und klinische Beratung HINWEIS: Im Falle von Patienten, die aus onkologischen Gründen eine Erhaltung der Fruchtbarkeit benötigen, stellen Sie sicher, dass es keine Warteliste für die Planung der Konsultation gibt und der Termin so schnell wie möglich zur Verfügung gestellt wird. Untersuchen Sie die Krankengeschichte und die vorherige Dokumentation und beurteilen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten. Zeichnen Sie alle Informationen (einsc…

Representative Results

Überblick über das Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm im Zentrum Über einen Zeitraum von 12 Jahren (2008-2020) wurden 285 Frauen mindestens einer Eizellentnahme unterzogen, was die Vitrifizierung der gesamten Kohorte der gesammelten reifen Eizellen beinhaltete. Die meisten dieser Frauen (n = 250) wurden einer einzigen Entnahme unterzogen, und 35 wurden mehreren Abrufen unterzogen. Die Gründe für die Eizellentnahme zur Vitrifizierung von Eizellen sind in 4 Kategorien zusamme…

Discussion

Klinische Überlegungen

Obwohl neue Strategien wie die Kryokonservierung von Eierstockgewebe und die In-vitro-Reifung erforscht wurden, ist die Vitrifikation von Eizellen nach COS die Goldstandardtechnik zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. In diesem Szenario sollte die Anzahl der entnommenen und kryokonservierten Eizellen in kürzester Zeit maximiert werden, da die meisten Krebspatientinnen möglicherweise nur von einem Eierstockzyklus profitieren, bevor sie mit ihrer Krebsbehan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts

Materials

Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).
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