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의학

卵母細胞ガラス化による不妊治療の保存:臨床および検査の視点

Published: September 16, 2021
doi:
10.3791/61963
, , , , , , ,
1Clinica Valle Giulia,GeneraLife IVF

Summary

卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の保存のためのゴールドスタンダードとしていくつかの国際科学協会によって認識されています。適切な臨床および実験室戦略は、最大の有効性、効率、および不妊治療の安全性を保証します。

Abstract

女性の生殖能力を維持することは、患者の将来の生活の質をケアする多機能医療システムにおいて重要です。卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の健康維持のためのゴールドスタンダードとして、いくつかの国際科学協会によって認識されています, 医療と非医学的適応症の両方のために.主な医学的適応症は、腫瘍疾患、重度の子宮内膜症などの婦人科疾患、卵巣予備軍を損なう全身性疾患、早期閉経を伴う遺伝的状態である。本論文では、客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングに関する推奨事項を概説することにより、不妊治療の臨床および実験室のワークアップ全体について説明する。さらに、それは処置の有効性に焦点を当て、卵巣予備軍を完全に利用し、最短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述する。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱分、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述されている。

Introduction

ヒト卵母細胞の効率的な凍結保存プログラムの開発と実施は、生殖医学における重要なブレークスルーとなっています。最近の証拠によると、ガラス化は、低凍結に比べて統計的に高い生存率をもたらすため、血相II(MII)卵子を凍結保存するための最も効果的な戦略であり、患者集団(不妊患者または卵母細胞の寄付プログラム)1、2、3とは無関係に。卵母細胞ガラス化の顕著な成果は、米国生殖医学会(ASRM)および生殖補助技術協会(SART)の実践委員会を導き、この技術が思春期後の女性の選択的不妊治療保存に最も効果的であると発音しました。不妊治療の保存のための医学的適応症には、(i)放射線療法、細胞傷害性化学療法、内分泌療法(卵巣予備軍に有害な影響が母親の年齢および治療の種類および用量に関連する)などの治療7を必要とする自己免疫疾患が含まれる。(ii) 繰り返しまたは根治的な手術を必要とする卵巣疾患 (子宮内膜症など)8;(iii)遺伝的状態(例えば、X-壊れやすい)または早期卵巣不全。さらに、不妊治療の保存は、非医学的理由(社会的凍結とも呼ばれる)のために親の目的を達成していないすべての女性にとって貴重な選択肢となっています。

不妊治療の保存の適応症に関係なく、不妊治療の保存に関する主要な国際ガイドラインに従って、すべての患者は、彼らの健康の成功の可能性、コスト、リスク、および手順9、10、11、12、13の限界について知らされる適切なカウンセリングを受けるべきである。最も重要なことは、MII卵母細胞のコホートを活性化することは妊娠を保証しないが、必要に応じて体外受精(IVF)治療のために成功する可能性が高いことを明らかにすべきである14。この点に関して、卵母細胞ガラス化時の女性の年齢は、確かに、進行した母親の年齢(AMA;>35歳)が女性不妊症の主な原因である15の最も重要な制限因子である。卵巣予備軍の進行性の減少に加えて、AMAは代謝、エピジェネティック調節、細胞周期チェックポイント、および細分性分離17のような生理的経路の欠陥による卵母細胞能力の障害と関連している。したがって、卵の合理的な数は主に母親の年齢に依存する。36歳未満の女性では、少なくとも8-10 MII卵母細胞18が成功の可能性を最大化する必要があります。一般に、ガラス化卵母細胞の数が多いほど、成功の可能性は高くなります。したがって、抗ミュレリアンホルモン(AMH)レベルまたはアントラル卵胞数(AFC)などの卵巣予備マーカーに従って卵巣刺激を調整することは、可能な限り短時間で卵巣予備を完全に利用するために重要である。

全体の手順の安全性は、不妊治療の保存のために患者を登録する際のもう一つの重要な問題です。臨床医は、リスクを最小限に抑え、(i)卵巣過剰刺激ホルモン(OHSS)などの安全なアプローチを使用してGnRHアゴニストトリガー19と(ii)リモートを防ぐために最善の戦略を採用する必要があります。 まだ可能, 腹膜出血のリスク, 骨盤構造への傷害 (尿管, 腸, 虫垂, 神経), 卵母細胞の検索中に骨盤感染.最後に、(iii)刺激のための伝統的なレジメンは、上端生理学的血清エストラジオールに関連付けられているため、乳癌などのエストロゲン感受性疾患では推奨されない。アロマターゼ阻害剤を含むプロトコル(レトロゾールまたはタモキシフェンなど)は、これらの場合20,21においてより適している。実験室での設定では、卵母細胞ガラス化のための最も広く普及したプロトコルは、クワヤマと同僚2、23によって最初に記述されたものであり、これは凍結保護剤(CPA)の段階的な添加を含む段階的な手順で構成されている。第1相(平衡/脱水)では、卵母細胞は7.5%v/vエチレングリコールおよび7.5%v/vジメチルスルホキシド(DMSO)を含むCPA溶液中に露出し、第2段階では卵母細胞を15%対/vエチレングリコールと15%v/v DMSO、プラス0.5糖質を含むガラス化溶液に移動する。ガラス化の媒体の短いインキュベーションの後、卵母細胞は、具体的に設計された開放性の凍結装置に配置することができ、最後に使用するまで保存される-196°Cで液体窒素に突っ込んだ。

ここでは、不妊治療の臨床および検査作業全体が(i)客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングのための勧告を概説し、(ii)処置の費用対効果に焦点を当て、(iii)卵巣予備軍を完全に利用し、可能な限り短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述することによって説明された。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱潤、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述される。このプロトコルの他のプロトコルまたは適応が文献に存在するので、この原稿の代表的な結果および議論のセクションはこの手順にのみ適用されます。

Protocol

1. ワークアップと臨床カウンセリング 注:腫瘍学的な理由で不妊治療を必要とする患者の場合は、スケジューリング相談の待機リストがないことを確認し、できるだけ早く予約を行ってください。 病歴と以前の書類を調べ、患者の一般的な健康状態を評価します。 すべての情報(がん患者の場合に卵巣刺激を受ける腫瘍学者の承認を含む)をリレーショナル?…

Representative Results

センターにおける不妊治療の保全プログラムの概要 12年間(2008-2020年)、285人の女性が収集された成熟した卵のコホート全体のガラス化を伴う少なくとも1つの卵母細胞検索を受けた。これらの女性のほとんど (n = 250) は 1 回の検索を受け、35 は複数の検索を受けました。卵ガラス化のための卵母細胞の検索を受ける理由は、4つのカテゴリに要約されています:医…

Discussion

臨床に関する考慮事項

卵巣組織凍結保存や体外成熟などの新たな戦略が探求されているが、COS後の卵母細胞ガラス化は生殖能力保存のためのゴールドスタンダード技術である。このシナリオでは、ほとんどのがん患者が癌治療を開始する前に1つの卵巣周期の恩恵を受ける可能性があるため、取得および凍結保存された卵母細胞の数は、可能な限り最短時間?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

何一つ

Materials

Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).
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