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의학

Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

Published: September 16, 2021
doi:
10.3791/61963
, , , , , , ,
1Clinica Valle Giulia,GeneraLife IVF

Summary

A criopreservação oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas. Estratégias clínicas e laboratoriais adequadas garantem a máxima eficácia, eficiência e segurança dos tratamentos de preservação da fertilidade.

Abstract

A preservação da fertilidade feminina é crucial em um sistema de saúde multifuncional que cuida da qualidade de vida futura das pacientes. A criopreservação de oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas. As principais indicações médicas são doenças oncológicas, doenças ginecológicas como endometriose grave, doenças sistêmicas que comprometem a reserva ovariana e condições genéticas envolvendo menopausa prematura. Este artigo descreve todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade, delineando recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências. Além disso, foca-se na eficácia do procedimento e descreve as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação foram detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança.

Introduction

O desenvolvimento e implementação de um programa eficiente de criopreservação para oócitos humanos tem sido um avanço significativo na medicina reprodutiva. De acordo com evidências recentes, a vitrificação é a estratégia mais eficaz para criopreservar os oócitos de metafase II (MII), pois resulta em taxas de sobrevivência estatisticamente mais elevadas em comparação com o congelamento lento, independentemente da população do paciente (pacientes inférteis ou programa de doação de oócitos)1,2,3. As realizações notáveis da vitrificação oócica levaram os Comitês de Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e da Sociedade de Tecnologia Reprodutiva Assistida (SART) a pronunciar essa técnica como a mais eficaz para a preservação da fertilidade eletiva em mulheres pós-aubertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas4,5,6. As indicações médicas para preservação da fertilidade incluem (i) câncer e doenças autoimunes que requerem terapias7, como radioterapia, quimioterapia citotóxica e terapia endócrina (cujo efeito prejudicial na reserva ovariana está associado à idade materna, bem como tipo e dose do tratamento); (ii) doenças ovarianas que requerem cirurgia repetida ou radical (como a endometriose)8; e (iii) condições genéticas (por exemplo, X-frágil) ou insuficiência ovariana prematura. Além disso, a preservação da fertilidade tornou-se uma opção valiosa para todas as mulheres que não realizaram seu objetivo parental por razões não médicas (também conhecidas como congelamento social).

Independentemente da indicação para a preservação da fertilidade e de acordo com as principais diretrizes internacionais sobre preservação da fertilidade, todos os pacientes dispostos a vitrifar seus oócitos devem receber aconselhamento adequado para serem informados sobre sua chance realista de sucesso, os custos, riscos e limitações do procedimento9,10,11,12,13. Mais importante, deve-se deixar claro que vitrificar uma coorte de oócitos MII não garante uma gravidez, mas que oferece uma maior chance de sucesso para o futuro tratamento de fertilização in vitro (FIV), se necessário14. Nesse sentido, a idade da mulher no momento da vitrificação do oócito é certamente o fator limitante mais importante15, pois a idade materna avançada (AMA; >35 anos) é a principal causa da infertilidade feminina16. Além de uma redução progressiva da reserva ovariana, a AMA está associada a um comprometimento da competência do oócito devido a vias fisiológicas defeituosas, como metabolismo, regulação epigenética, pontos de verificação do ciclo celular e segregação média17. Portanto, o número razoável de ovos para vitrify depende principalmente da idade materna. Em mulheres com menos de 36 anos, pelo menos 8-10 oócitos MII18 são necessários para maximizar a chance de sucesso. Em geral, quanto maior o número de oócitos vitrificados, maior é a probabilidade de sucesso. Portanto, a adaptação da estimulação ovariana de acordo com marcadores de reserva ovariana, como os níveis de hormônio anti-Mülleriano (AMH) ou a contagem de folículos antral (AFC) é crucial para explorar totalmente a reserva ovariana no menor tempo possível.

A segurança de todo o procedimento é a outra questão fundamental na inscrição de pacientes para preservação da fertilidade. Os médicos devem empregar as melhores estratégias para minimizar os riscos e prevenir (i)síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS) usando abordagens seguras, como o protocolo antagonista do hormônio liberador de gonadotrophin (GnRH), seguido por um agonista gnrh gatilho19 e (ii) o remoto, ainda possível, riscos de hemorragia peritoneal, lesão nas estruturas pélvicas (ureter, intestino, apêndice, nervos) ou infecção pélvica durante a recuperação do oócito. Por fim, (iii) os regimes tradicionais de estimulação estão associados ao estradiol soro suprafisiológico e, portanto, não são recomendados em doenças sensíveis ao estrogênio, como o câncer de mama. Protocolos envolvendo inibidores de aromatase (como letrozol ou tamoxifen) são mais adequados nesses casos20,21. No ambiente laboratorial, o protocolo mais difundido para vitrificação de oócitos ainda é o primeiro descrito por Kuwayama e seus colegas2,23, que consiste em um procedimento passo a passo envolvendo a adição gradual de crioprotetores (CPAs). Na primeira fase (equilíbrio/desidratação), os oócitos são expostos em uma solução CPA contendo 7,5% v/v de etileno glicol e 7,5% v/v de sulfóxido de dimetil (DMSO), enquanto na segunda fase, osócitos são movidos para uma solução de vitrificação com 15% v/v de etileno glicol e 15% v/v DMSO, mais 0,5 mol/L sacarose. Após uma breve incubação no meio da vitrificação, os oócitos podem ser colocados em criodes específicos, abertos e finalmente mergulhados em nitrogênio líquido a -196 °C para serem armazenados até o uso.

Aqui, todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade foi descrito por (i) delinear recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências, (ii) com foco no custo-efetividade do procedimento, e (iii) descrever as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação serão detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança. Como existem outros protocolos ou adaptações desse protocolo na literatura, os resultados representativos e as seções de discussão deste manuscrito só se aplicam a este procedimento.

Protocol

1. Work-up e aconselhamento clínico NOTA: No caso de pacientes que necessitam de preservação da fertilidade por razões oncológicas, certifique-se de que não há lista de espera para consulta de agendamento, e a consulta é fornecida o mais rápido possível. Examine o histórico médico e a documentação prévia e avalie o estado geral de saúde do paciente. Registo todas as informações (incluindo a aprovação do oncologista para se submeter à estimulação ovari…

Representative Results

Visão geral do programa de preservação da fertilidade no centro Durante um período de 12 anos (2008-2020), 285 mulheres foram submetidas a pelo menos uma recuperação de oócitos, implicando a vitrificação de toda a coorte de ovos maduros coletados. A maioria dessas mulheres (n=250) foi submetida a uma única recuperação, e 35 foram submetidas a múltiplas recuperações. As razões para a recuperação de oócitos para vitrificação de óvulos são resumidas em 4 ca…

Discussion

Considerações clínicas

Embora estratégias emergentes, como a criopreservação do tecido ovariano e a maturação in vitro, tenham sido exploradas, a vitrificação oócida após a COS é a técnica padrão-ouro para a preservação da fertilidade. Nesse cenário, o número de oócitos recuperados e criopreservados deve ser maximizado no menor tempo possível, pois a maioria dos pacientes com câncer pode se beneficiar apenas de um ciclo ovariano antes de ter que iniciar …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nenhum

Materials

Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).
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