En allsidig mikrofluidisk enhet er beskrevet som muliggjør krystallisering av et enzym ved hjelp av motdiffusjonsmetoden, innføring av et substrat i krystallene ved bløtlegging, og 3D-strukturen bestemmelse av enzymet:substrat kompleks av en seriell analyse av krystaller inne i brikken ved romtemperatur.
Utarbeidelsen av godt diffracting krystaller og deres håndtering før deres røntgenanalyse er to kritiske trinn i biokrystallografiske studier. Vi beskriver en allsidig mikrofluidisk chip som muliggjør produksjon av krystaller ved effektiv metode for motdypfusjon. Det konveksjonsfrie miljøet fra mikrofluidiske kanaler er ideell for krystallvekst og nyttig for å spre et substrat i det aktive stedet for det krystallinske enzymet. Her brukte vi denne tilnærmingen til CCA-legge enzymet i den psykiske bakterien Planococcus halocryophilus i det presenterte eksemplet. Etter krystallisering og substratdiffusjon/soaking ble krystallstrukturen til enzymet:substratkomplekset bestemt ved romtemperatur ved seriell krystallografi og analyse av flere krystaller rett inne i brikken. Hele prosedyren bevarer de ekte diffraksjonsegenskapene til prøvene fordi det ikke krever krystallhåndtering.
Krystallografi er en metode for å tyde 3D-arkitekturen til biologiske makromolekyler. Sistnevnte er viktig å forstå hvordan et enzym velger og behandler sine substrater. Fastsettelsen av en krystallstruktur krever krystallisering av målet makromolekyl og kondisjonering av krystallene for deres analyse ved røntgendiffraksjon1. Både krystallforberedelse og håndtering er avgjørende, men delikate trinn som kan påvirke krystallkvalitet og diffraksjonsegenskaper, og dermed oppløsningen (det vil si nøyaktigheten) til den resulterende 3D-strukturen. For å lette utarbeidelsen av krystaller av høy kvalitet og eliminere unødvendig håndtering for å bevare deres diffraksjonsegenskaper, designet vi en brukervennlig og allsidig mikrofluidisk enhet kalt ChipX2,3,4.
I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan du laster proteinløsningen inn i ChipX-kanaler ved hjelp av konvensjonelt laboratoriemateriale for å forberede krystaller ved motdypfusjon. Denne krystalliseringsmetoden gir en effektiv screening av supermetning og potensielle kjerneforhold langs mikrofluidiske kanaler som inneholder enzymløsningen på grunn av konsentrasjonsgradienten som genereres av diffusjonen av krystalliseringsmiddelet5,6.
Chip oppsettet er enkelt, den bruker bare standard laboratoriepipetter og krever ikke noe kostbart utstyr. Når krystaller har vokst i ChipX, kan ligander av enzymet innføres ved diffusjon. Diffraksjonsdata samles deretter ved romtemperatur på en rekke krystaller som finnes i kanalene til brikken ved hjelp av en synchrotron røntgenkilde. Den strukturelle studien beskrevet her førte til bestemmelse av strukturer av et tRNA modningsenzym i sin apoform og i kompleks med en analog av CTP-substratet introdusert av soaking. Dette proteinet kalles CCA-tilføyende enzym polymeriserer CCA trinukleotid halen på 3 ‘slutten av tRNAs. Sammenligningen av de to 3D-bildene oppnådd ved seriekrystallografi avslører de lokale konformasjonsendringene knyttet til bindingen av ligande i forhold som er mer fysiologiske enn de som brukes i kryokrystallografi. Protokollen som er beskrevet i denne videoen, gjelder generelt for biomolekyl, det være seg et protein, en nukleinsyre eller et multikomponentkompleks.
Nåværende protokoller i biokrystallografi innebærer fremstilling av krystaller ved hjelp av metoder som dampdiffusjon eller batch13,14,og deres overføring til en mikroloop for kryokjøling15,16 før du utfører diffraksjonsanalysen i en nitrogenstråle ved kryogene forhold. Direkte krystallkryokjøling er derimot ikke mulig i ChipX3, og krystaller kan ikke ekstraheres fra mikrofluidisk kanal, som kan ses på som begrensninger i dette oppsettet. Protokollen som er beskrevet i artikkelen, gir imidlertid en fullt integrert rørledning for bestemmelse av krystallstrukturer ved romtemperatur (det vil at i mer fysiologiske forhold). Selv om datainnsamling ved romtemperatur forårsaker en økning av strålingsskader19, motvirkes denne effekten av rask datainnsamlingstid (maksimalt 60 ° rotasjon samles på hver krystall) og ved sammenslåing av flere delvise datasett. Både ChipX design og materiale ble optimalisert for å redusere bakgrunnsspømming og diffraksjonssignal demping3,og datainnsamling kan utføres på krystaller med dimensjoner som tilsvarer halvparten av størrelsen på kanalene (40 μm)4.
For å oppsummere er de viktigste fordelene med protokollen følgende. Krystallene produseres i et konveksjonsfritt miljø (mikrofluidiske kanaler), noe som er svært gunstig for veksten av krystaller av høy kvalitet. Motdypfusjonsmetoden implementert i ChipX er svært effektiv til å screene supermetningslandskapet; diffusjonen av krystalllanter inn i chipkanalen skaper en konsentrasjons- og supermetningsbølge som bidrar til å bestemme passende kjerne- og vekstforhold5. Krystaller håndteres aldri direkte, men analyseres in situ, inne i brikken, som bevarer deres ekte diffraksjonsegenskaper (det vil si at det ikke endrer krystallmosaikkitet ved fysisk interaksjon eller kryoooling)20. Diffraksjonsanalysen utføres på en rekke krystaller fordelt langs chipkanalene med lav doseeksponering for å minimere strålingsskader, og et fullstendig datasett er montert ved å slå sammen delvise data fra serien. Standardfotavtrykket og den enkle utformingen av ChipX vil i fremtiden tillate en fullstendig automatisering av in situ-datainnsamling ved hjelp av synchrotron- eller XFEL-anlegg. Alle trinnene i protokollen utføres i ChipX. Fra eksperimenterersynspunktet er chipoppsettet enkelt og enkelt å utføre med standard pipetter og krever ikke noe ekstra utstyr. Den trelignende kanaltilkoblingen ved prøveinntaket minimerer døde volumer i systemet, noe som er viktig når du arbeider med prøver som er vanskelige å rense eller som bare er tilgjengelige i begrenset antall.
Til slutt forenkler og effektivt miniaturizes prosessen med krystallisering ved motdiffusjon og krystallstrukturbestemmelse, slik at den kan gå fra prøven til 3D-strukturen i en enkelt enhet. Det er allment aktuelt og tilbyr en brukervennlig, kostnadseffektiv løsning for rutinemessige seriell biokrystallografi undersøkelser ved romtemperatur.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner den sveitsiske lyskilden (Villigen, Sveits) for stråletid tildeling til prosjektet på beamlines X10SA (PXII) og X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm for hennes bidrag til struktur raffinement, Clarissa Worsdale for innspillingen av voiceover og François Schnell (Université de Strasbourg) for hans hjelp i videoredigering og SFX. Dette arbeidet ble støttet av det franske senteret National de la Recherche Scientifique (CNRS), Universitetet i Strasbourg, LabEx-konsortiet “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en ph.d.-finansiering til R.dW fra Excellence-initiativet (IdEx) ved Universitetet i Strasbourg i rammen av det franske nasjonale programmet “Investissements d’Avenir”, en ph.d.-finansiering til K.R. fra det fransk-tyske universitetet (UFA-DFH, gir nei. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (gi nr. Mo 634/10-1). Forfatterne dro nytte av PROCOPE Hubert Curien samarbeidsprogram (det franske utenriksdepartementet og Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |