Denna artikel beskriver ett protokoll för manipulering av molekylära mål i hjärnbarken med hjälp av adeno-associerade virus och för övervakning av effekterna av denna manipulation under vakenhet och sömn med hjälp av elektrocorticographic inspelningar.
Användningen av elektrokortektiska (ECoG) inspelningar hos gnagare är relevant för sömnforskning och för studier av ett brett spektrum av neurologiska tillstånd. Adeno-associerade virus (AAV) används alltmer för att förbättra förståelsen för hjärnkretsar och deras funktioner. AAV-medierad manipulering av specifika cellpopulationer och/eller exakta molekylära komponenter har varit oerhört användbar för att identifiera nya sömnreglerande kretsar/molekyler och viktiga proteiner som bidrar till de negativa effekterna av sömnförlust. Till exempel förhindrar hämmande aktivitet hos filamentösa aktin-avskiljande protein cofilin med hjälp av AAV sömnbrist-inducerad minnesförsämring. Här beskrivs ett protokoll som kombinerar manipulering av cofilin funktion i ett hjärnbark område med registrering av ECoG verksamhet för att undersöka om när cofilin modulerar vakenhet och sömn ECoG signaler. AAV injektion utförs under samma kirurgiska ingrepp som implantation av ECoG och elektromyographic (EMG) elektroder i vuxna manliga och kvinnliga möss. Möss bedövas och deras huvuden rakas. Efter hudrengöring och snitt bestäms stereotaxiska koordinater för motorbarken, och skallen genomborras på denna plats. En kanyl förfylld med en AAV som uttrycker cofilinS3D, en inaktiv form av cofilin, placeras långsamt i den närvävnaden. Efter AAV-infusion skruvas guldtäckta skruvar (ECoG-elektroder) genom skallen och cementeras till skallen med guldtrådar insatta i nackmusklerna (EMG-elektroder). Djuren får tre veckor på sig att återhämta sig och för att säkerställa ett tillräckligt uttryck för cofilinS3D. Det infekterade området och celltypen verifieras med immunohistokemi, och ECoG analyseras med hjälp av visuell identifiering av vaksamhet tillstånd och spektral analys. Sammanfattningsvis tillåter detta kombinerade metodologiska tillvägagångssätt undersökningen av det exakta bidraget från molekylära komponenter som reglerar neuronal morfologi och anslutning till reglering av synkroniserad hjärnbarkaktivitet under vakenhet och sömn.
Elektroencefalografiska (eller i allmänhet elektrokortikografiska [ECoG] hos gnagare) och elektromyografiska (EMG) inspelningar används i stor utsträckning i sömnforskning samt mer allmänt inom neurovetenskap, neurologi och psykiatri. I kombination möjliggör dessa elektrofysiologiska signaler identifiering av vaksamhetstillstånd och efterföljande kvantifiering av tillståndstid och spektralsammansättning, både hos människor och gnagare1,2,3,4. Sådan kvantifiering har varit användbar för att förstå hur sömn modifieras i patologiska tillstånd som neurodegenerativa sjukdomar och modellerna5,6,7 ellergenom genetisk modifiering8,9. Till exempel visades knockout (KO) av olika gener kopplade till neuronal kommunikation ändra varaktigheten av vakenhet och sömn i både musen ochfruktflugan 10,11,12,13. För att hantera potentiell utvecklingskompensation som härrör från studier av helkropps KO hos gnagare och för att möjliggöra en finare kontroll av genetisk manipulering är ett effektivt sätt att manipulera genuttryck att använda adeno-associerade virus (AAV). En AAV-medierad genetisk manipulation kan användas för att ned- eller uppreglera ett givet molekylärt mål och för att begränsa manipuleringen till en specifik cellpopulation med hjälp av olika typer avpromotors 14. AAV används också i stor utsträckning som leveransmetod i de klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR)/Cas9-teknik15,16. Dessa metoder möjliggör bättre tidsmässiga och rumsliga kontroll av genetisk manipulation, som i allmänhet är associerad med uttrycket av en reporter tillåter kvantifiering av det infekterade området med hjälp av immunofluorescens.
AAV representerar också huvudvektorn för celltypspecifika manipuleringar av neuronal aktivitet via optogenetik och kemogenetik17,18,19, som har använts i stor utsträckning i ny forskning om neurodegenerativa sjukdomar, beteende, kognition och sömn20,21,22. I sömnforskning har tillämpningen av optogenetik för aktivering eller hämning av vissa hjärnregioner, såsom basalt förhjärna, hypotalamus och sublaterodorsaltegmentum, varit användbar för att bestämma deras roller i kontrollen av upphetsning, långsam vågsömn (även känd som icke-snabb ögonrörelsesömn), paradoxal sömn (eller snabb ögonrörelsesömn) och kataplexi23, 24,25. Dessutom har AAV-medierade manipuleringar hjälpt till att belysa viktiga sömnreglerande kretsar och molekyler som bidrar till de negativa effekterna av sömnförlust26,27,28. Till exempel är ett protein som visat sig vara inblandat i sömnbrist-inducerad minnesförsämring cofilin29,30. Detta protein är ett filamentöst aktinsnedskiljande protein som deltar i omorganiseringen av aktinfilament genom att fysiskt binda till aktin och främja demonteringen av glödtrådarna på ett dynamiskt sätt31. Hämma kofilinaktivitet med hjälp av en AAV-medierad metod visade sig förhindra ryggradsförlust samt synaptisk plasticitet och minnesunderskott inducerade av sömnbrist hos möss29. Sammantaget betonar dessa studier nyttan och relevansen av AAV-medierade manipuleringar för att förstå sömnreglering och konsekvenserna av sömnbrist hos gnagare.
Här beskrivs ett protokoll som kombinerar ECoG och EMG elektrod implantation och inspelning med manipulering av cofilin funktion i en hjärnbark område av vilda typer (WT) möss med hjälp av en AAV. Mer exakt injiceras en AAV (serotyp 9) som uttrycker kodningssekvensen av en fosfomimetisk form av muskofilin (cofilinS3D),vilket gör den inaktiv32,33, i motorbarken (M1 och M2). En ECoG-elektrod implanteras direkt på injektionsstället för att säkerställa registrering av de infekterade cellernas synkroniserade kortikala aktivitet. ECoG/EMG-registreringen utförs i 24 timmar under ostörda förhållanden tre veckor efter operationen för att möjliggöra återhämtning, anpassning och hög cofilinS3D-uttryck. Registreringen används sedan för identifiering av vaksamhetsstater och ECoG-spektralanalys, enligt beskrivningen i tidigarestudier 11,34. Denna metodik kan specifikt avslöja hur när cofilin modulerar vakenhet och sömn ECoG signaler hos möss. Denna kombination av elektrofysiologiska inspelningar och AAV-medierad genetisk manipulation är särskilt relevant för att undersöka olika molekylära elements roller i specifika hjärnfunktioner och kan tillämpas på när (och subkortikala) hjärnområde av intresse för WT och genetiskt modifierade möss av båda könen och till och med andra arter.
Detta protokoll beskriver en exakt och enkel metod för att övervaka ECoG och EMG aktivitet under manipulering av molekylära mål med hjälp av AAV. För adekvat jämförelse mellan grupper rekommenderas det starkt att alltid planera kirurgiska ingrepp (AAV- injektion och elektrodimplantation) samma dag för test- och kontrolldjur och att registrera deras elektrofysiologiska signaler samtidigt. För att få liknande virusuttryck mellan test- och kontrolldjuren är det önskvärt att injicera samma virala titer. I förevarande fall hade viral titer av kontroll AAV minskats till hälften av testet AAV för att säkerställa liknande virala uttryck. Försöksarbetare bör vara mycket försiktiga med mätningar av stereotaxiska koordinater för att säkerställa låg variation mellan djur i hjärnans område/närskiktsinriktning. Med tanke på att injektionsdjupet beräknas från skallens yta och att skalltjockleken varierar med ålder och kön, bör dessutom kanylens placering alltid kontrolleras med hjälp av histologi efter protokollet eller immunohistokemi (t.ex. figur 2) för att säkerställa adekvat positionering/injektionsdjup, och stereotaxiska koordinater bör justeras vid behov. Under hela 40-minuters AAV-injektionen är det mycket viktigt att övervaka injektionshastigheten för att snabbt upptäcka och korrigera potentiella problem som pumpblockering. Vissa experimentella steg är också avgörande för att få optimala elektrofysiologiska signaler. Till exempel, överskruva inte under elektrodimplantation; skruvar bör sticka ut ur skallen med minst 2,5 mm för att minimera skador på hjärnbarken och bildandet av ett gliaärr. Efteråt är det också oerhört viktigt att i) undvika att applicera cement på elektrodernas extremiteter, ii) säkerställa en snabb lödning av elektroderna till kontakten, och iii) se till att det inte finns någon kontakt mellan elektroderna.
Förfarandet som presenteras här för ECoG- och EMG-inspelning är extremt väletablerat, enkelt och används ofta för att övervaka vakenhet och sömn hos möss2,11,13,34. Kontinuerliga ECoG- och EMG-inspelningar kan utföras under flera på varandra följande dagar (och till och med veckor) och generera en mycket rik datauppsättning som kan användas för att utföra flera analyslinjer som omfattar variabler relaterade till vakenhet och sömnmängd ocharkitektur 2,11,12 (t.ex. tid som spenderas i olika tillstånd per ljusa och mörka perioder, antal episoder av varje stat, 24-h fördelning av sömn), vakenhet och sömnspektralainnehåll 34,41 (t.ex. effekt i olika frekvensband [liknande figur 3], skalfri aktivitet) och egenskaper hos enskildavågor 42,43,44 (t.ex. långsam våg amplitud och lutning). När det används i kombination med AAV-medierade molekylära manipuleringar är en ytterligare fördel att undvika potentiell utvecklingskompensation som kan uppstå hos transgena djur. Med övning kan hela proceduren, inklusive 40-minuters AAV-injektion, utföras på cirka 90 minuter. Dödligheten bör vara (mycket) låg eftersom operationen är minimalt invasiv.
Samtidig användning av ECoG / EMG-inspelning och riktad manipulation med AAV erbjuder en mängd andra fördelar och applikationer. Till exempel är precisionen i stereotaxisk inriktning, när den utförs på ett adekvat sätt, mycket hög och reproducerbar och är användbar för att bestämma den specifika rollen för en viss hjärnregion (och/eller en celltyp eller ett molekylärt element inom regionen) vid reglering av sömn eller andra fysiologiska processer. Flera olika närområden kan därför enkelt riktas med hjälp av anpassningar av det nuvarande protokollet. Dessutom kan målmanipulationer med hjälp av AAV riktas till ett när-/subkortikalt område som skiljer sig från ECoG-inspelningsplatserna. I sådana fall kan gradhålet för AAV-injektion täckas av ett litet glaslock fixerat med dental cement (eller benvax). För förbättrad specificitet innehåller AAV-konstruktionen ofta en promotor som möjliggör riktad infektion av en exakt celltyp14. En CamKIIα promotor användes i det nuvarande protokollet för att specifikt rikta excitatoriska pyramidalaceller 14,29,45av motor cortex. Denna strategi har möjliggjort inaktivering av cofilin (med hjälp av cofilinS3D)32,33 i excitatoriska nervceller i motorbarken och observation av tillståndsspecifika förändringar i ECoG-aktivitet ( Figur3). För att bedöma infektion/transduktion effektivitet, framtida protokoll användare kan kombinera det presenterade AAV-ECoG protokollet med en av co-staining av immunofluorescence, och använda hög förstoring bilder för att beräkna antalet celler som visar dubbelmärkning av det totala antalet celler som visar en märkning av målet (här CaMKIIα-uttrycker nervceller). I en ny studie användes en AAV-ECoG-metod som liknar den som beskrivs här för att överuttrycka bräckligt X utvecklingsstörningssyndromrelaterat protein 1 (FXR1) i alla nervceller i motorbarken med hjälp av en AAV som innehåller en synapsinpromotor och visade en effekt av denna manipulation på vaksamhetstillståndfördelning och spektralinnehåll28. Dessa resultat illustrerar hur manipulera en viss molekyl i en målhjärnregion med hjälp av AAV kan avslöja roller i regleringen av specifika vakenhet / sömn parametrar.
En begränsning av det beskrivna protokollet är den lilla lesion av hjärnvävnad som uppstår med kanyl placering innan utföra AAV injektion, som också kan åtföljas av ett inflammatoriskt svar. Detta kan vara särskilt oroande när du utför AAV injektion i subkortikala områden och bör alltid hanteras med hjälp av lämpliga kontroller. Alternativt kan det nuvarande protokollet följas av kvantifiering av reaktiv gliosis och/eller mikroglial aktivering (t.ex. med hjälp av immunofluorescens) för att säkerställa liknande nivåer i kontroll- och testgrupper och därmed på ECoG-avläsningen. En andra begränsning gäller risken för dålig anslutning mellan en elektrod och kontakten, vilket kan resultera i en kontinuerligt eller ibland dålig elektrofysiologisk signal. Fast skruvade, lödda och cementerade elektroder minimerar förekomsten av detta problem. En tredje begränsning är relaterad till djur som tjudrars via huvudmontage under inspelningen, vilket kan begränsa rörelse och andra beteenden, åtminstone i viss utsträckning, och ibland resultera i kabelskador och signalförlust. Slutligen är det presenterade protokollet mer lämpligt för vuxna möss, med tanke på att skallstorleken hos yngre djur kan orsaka svårigheter att installera det avbildade huvudmontaget, som beskrivits tidigare2.
Kombinerad ECoG/EMG-inspelning och AAV-medierad manipulering av ett exakt mål är också tillämpligt på andra forskningsområden än sömnens neurovetenskap. Bland annat kan det användas för att studera och manipulera epileptiska händelser i djurmodeller av anfall och är ett kraftfullt verktyg för att modulera hjärnoscillationer som är involverade i minneskodning och konsolidering46,47. Följaktligen omfattar potentiella tillämpningar verkligen områdena grundforskning inom psykiatri och neurologi, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Förutom förmågan att uttrycka en inaktiv form av en molekyl kan och har AAV använts för att överuttrycka eller nedreglera (t.ex. små störande RNA, CRISPR/Cas9) eller för att rädda uttrycket av en molekyl i en helkropps KO. Viktigt är att den dubbla metoden i det nuvarande protokollet också är tillämplig på andra däggdjursarter som råttor och dagliga gnagare som representerar intressanta modeller för att förstå både sömn och neurodegeneration48,49.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet finansierades av Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. Författarna är tacksamma mot Chloé Provost och Caroline Bouchard för teknisk hjälp.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |