本文描述了使用腺相关病毒操作大脑皮层分子靶点的规程,以及使用电皮质记录监测这种操作在觉醒和睡眠期间的影响。
在啮齿动物中使用电皮质(ECoG)记录与睡眠研究和各种神经系统疾病的研究有关。腺相关病毒 (AAV) 越来越多地用于增进对大脑回路及其功能的理解。AAV介于特定细胞群和/或精确分子成分的操作对于识别新的睡眠调节回路/分子和导致睡眠损失不利影响的关键蛋白质非常有用。例如,使用 AAV 抑制长丝作用素切除蛋白科菲林的活动可防止睡眠剥夺引起的记忆障碍。在这里,描述了一个协议,结合了大脑皮层区域的科菲林功能的操作与ECoG活动的记录,以检查皮质科菲林是否调节觉醒和睡眠ECoG信号。AAV注射与成年雄性小鼠和雌性小鼠植入ECoG和电极(EMG)电极的外科手术相同。老鼠麻醉了,头都剃了。皮肤清洁和切口后,确定运动皮层的立体定向坐标,头骨在此位置被刺穿。预填充AAV表达科菲林S3D的管子,一种非活性形式的科菲林,慢慢地被放置在皮质组织中。AAV输液后,金盖螺丝(ECoG电极)拧过头骨,用插入颈部肌肉(EMG电极)的金丝粘在头骨上。动物可以三个星期恢复,并确保足够的表达科菲林S3D。使用免疫造血术验证受感染区域和细胞类型,使用警戒状态的视觉识别和光谱分析分析ECoG。总之,这种综合方法论方法可以研究分子成分对调节神经元形态和连接对清醒和睡眠期间同步大脑皮层活动调节的精确贡献。
脑电图(或啮齿动物一般电皮质学[ECoG])和电致像(EMG)录音被广泛用于睡眠研究,以及更广泛的神经科学、神经学和精神病学。综合起来,这些电生理信号允许识别警惕状态,并随后量化状态持续时间和光谱组成,包括人类和啮齿动物1,2,3,4。这种量化有助于理解睡眠是如何在病理条件下(如神经退行性疾病和模型5、6、7或基因改造8、9)中改变的。例如,与神经元通信相关的不同基因的敲除(KO)被证明可以改变小鼠和果蝇10、11、12、13的清醒和睡眠时间。为了解决啮齿动物全身KO研究产生的潜在发育补偿问题,并允许更精细地控制基因操纵,操纵基因表达的有效方法是使用腺相关病毒(AAV)。AAV介质的基因操纵可用于降低或调高给定的分子靶点,并利用不同类型的促进剂将操纵限制在特定细胞群中。AAV也广泛用作交付方法,在集群定期间歇短回音重复(CRISPR)/Cas9技术15,16。这些方法允许更好地在时间和空间上控制遗传操作,这通常与记者的表达有关,允许使用免疫荧光对感染区域进行量化。
AAV还代表通过光遗传学和化学遗传学17,18,19的细胞类型特定操作神经元活动的主要载体,这些载体已广泛应用于最近关于神经退行性疾病、行为、认知和睡眠20、21、22的研究中。在睡眠研究中,光遗传学对激活或抑制某些大脑区域(如基底前脑、下丘脑和下腹血糖)的应用,有助于确定它们在控制唤醒、慢波睡眠(也称为非快速眼动睡眠)、自相矛盾的睡眠(或快速眼动睡眠)和阴极23中的作用。 24,25。此外,AAV调解的操作有助于阐明重要的睡眠调节电路和分子导致睡眠损失的不利影响26,27,28。例如,一种蛋白质被证明与睡眠剥夺引起的记忆障碍有关,是科菲林29,30。这种蛋白质是一种细丝作用素分离蛋白,通过物理结合作用和促进长丝的拆解在动态的方式31参与行动素丝的重组。使用 AAV 介导的方法抑制科菲林活动被证明可以防止脊椎丧失以及突触可塑性和记忆缺陷引起的小鼠睡眠剥夺29。总的来说,这些研究强调了AAV介导操作的有用性和相关性,以了解睡眠调节和啮齿动物睡眠剥夺的后果。
在这里,描述了一个协议,结合ECoG和EMG电极植入和记录与操作科菲林功能在大脑皮层区域的野生类型(WT)小鼠使用AAV。更确切地说,AAV(血清型9)表示小鼠科菲林(cofilinS3D)磷化形式的编码序列,使其处于非活动状态32,33,被注射到运动皮层(M1和M2)中。ECoG 电极直接植入注射部位,以确保记录受感染细胞的同步皮质活性。ECoG/EMG 记录在手术后三周内在不受干扰的条件下进行 24 小时,以便恢复、适应和高科菲林S3D表达。然后,录音用于识别警戒状态和ECoG光谱分析,如前一研究11,34所述。这种方法可以具体揭示皮质科菲林如何调节小鼠的觉醒和睡眠ECoG信号。这种电生理记录和AAV介质基因操作的结合对于研究各种分子元素在特定大脑功能中的作用特别相关,可以应用于WT和转基因两性小鼠以及其他物种感兴趣的皮质(和皮下)大脑区域。
该协议描述了一种精确而直接的方法,在使用 AAV 操作分子目标时监控 ECoG 和 EMG 活动。为了进行充分的组间比较,强烈建议在测试和控制动物的同一天始终计划外科手术(AAV注射和电极植入),并同时记录其电生理信号。为了在测试和控制动物之间获得类似的病毒表达,注射相同的病毒滴答声是可取的。在本例中,控制 AAV 的病毒滴答声已减少到测试 AAV 的一半,以确保类似的病毒表达。实验者应该非常小心地测量立体定向坐标,以确保在大脑区域/皮质层靶点的低动物间变异性。此外,鉴于注射深度是从头骨表面计算的,而且头骨厚度随年龄和性别而变化,因此应始终使用协议后组织学或免疫造血术(如 图2)验证管位,以确保注射的充分定位/深度,必要时应调整立体定向坐标。在整个 40 分钟的 AAV 注射过程中,监控注射速度以快速检测和纠正泵阻塞等潜在问题非常重要。一些实验步骤对于获得最佳的电生理信号也至关重要。例如,在电极植入过程中不要过度拧干:螺丝应坚持出头骨至少2.5毫米,以尽量减少对大脑皮层的损害和胶质疤痕的形成。之后,避免将水泥涂在电极的四肢上也非常重要,ii) 确保电极快速焊接到连接器上,iii) 确保电极之间没有接触。
这里介绍的ECoG和EMG记录程序是非常成熟,简单,并广泛用于监测唤醒和睡眠的小鼠2,11,13,34。连续的 ECoG 和 EMG 录音可以连续执行几天(甚至数周),并生成非常丰富的数据集,可用于执行多个分析行,包括与觉醒和睡眠量相关的变量和架构 2、11、12(例如,每个光和暗时期在不同状态下花费的时间、每个状态的情节数、 24小时睡眠分布)、觉醒和睡眠光谱含量34、41(例如,不同频段的功率[类似于图3],无尺度活动),以及单波42、43、44(例如慢波振幅和坡度)的特征。当与 AAV 介质分子操作相结合时,另一个优势是避免了转基因动物中可能发生的潜在发育补偿。通过练习,整个过程,包括40分钟的AAV注射,可以在大约90分钟内完成。死亡率应该(非常)低,因为手术是微创的。
同时使用 ECoG/EMG 记录和 AAV 进行定向操作,提供了各种其他优势和应用。例如,立体定向目标的精度,当充分执行时,是非常高和可复制的,有助于确定给定的大脑区域(和/或区域内的细胞类型或分子元素)在调节睡眠或其他生理过程中的具体作用。因此,使用当前协议的适应,可以轻松地瞄准几个不同的皮质区域。此外,使用 AAV 的目标操作可以定向到与 ECoG 记录站点不同的皮质/皮下区域。在这种情况下,AAV 注射的毛刺孔可以用牙科水泥(或骨蜡)固定的小玻璃盖片覆盖。为了增强特异性,AAV 结构通常包括一个促进器,允许精确细胞类型14的定向感染。在本协议中,使用CamKII®促进器专门瞄准运动皮层的兴奋金字塔细胞14、29、45。该策略使焦精(使用科菲林S3D)32,33在运动皮层的兴奋神经元和观察ECoG活动状态特定的变化(图3)的灭活性。为了评估感染/转导功效,未来的协议用户可以将呈现的 AAV-ECoG 协议与免疫荧光共染的方案相结合,并使用高放大倍率图像计算显示目标单标签的细胞总数中的双标签细胞数量(这里,CaMKII® 表达神经元)。在最近的一项研究中,AAV-ECoG方法与这里描述的方法类似,它使用含有突触促进器的AAV在运动皮层的所有神经元中过度表达脆弱的X智力迟钝综合征相关蛋白质1(FXR1),并揭示了这种操作对警惕状态分布和光谱含量的影响28。这些发现说明了使用 AAV 在目标大脑区域操纵给定分子如何揭示特定觉醒/睡眠参数调节中的作用。
所述协议的一个限制是脑组织在进行 AAV 注射之前与管子放置发生的小病变,这也可能伴有炎症反应。在皮下区域进行 AAV 注射时,这可能特别令人关注,并且应始终使用适当的控制来解决。或者,在目前的协议之后,可以量化活性胶质疏松和/或微胶质活化(例如,使用免疫荧光),以确保控制和测试组的类似水平,因此,在ECoG读数上。第二个限制与电极和连接器之间连接不良的风险有关,这可能导致持续或偶尔的坏电生理信号。固体拧紧、焊接和粘固电极将最大限度地减少此问题的发生率。第三个限制与动物在录音过程中通过头部蒙太奇系绳有关,这可能会限制运动和其他行为,至少在一定程度上,偶尔会导致布线损坏和信号丢失。最后,鉴于年轻动物的头骨大小可能会在安装描绘的头蒙太奇时出现困难,因此所呈现的协议更适合成年小鼠,如前2所述。
ECoG/EMG 记录和 AAV 介于精确目标的操纵相结合也适用于睡眠神经科学以外的研究领域。除其他外,它可以用来研究和操纵癫痫发作模型中的癫痫事件,是调节大脑振荡涉及记忆编码和巩固的有力工具46,47。因此,潜在的应用当然包括精神病学和神经学的基础研究领域,包括神经退行性疾病。除了表达分子非活动形式的能力外,AAV 还可以而且已经用于过度表达或降低调节(例如,小干扰RNA、CRISPR/Cas9)或拯救全身 KO 中分子的表达。重要的是,目前协议的双重方法也适用于其他哺乳动物物种,如大鼠和日间啮齿动物,代表有趣的模型,以了解睡眠和神经退化48,49。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由加拿大睡眠分子生理学研究主席资助。作者感谢克洛埃·普罗沃斯特和卡罗琳·布查德的技术帮助。
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |