Method Article

얼룩말피에서 척추동물 세분화를 연구하는 3-D 꼬리 이식 문화

DOI:

10.3791/61981

⸱

June 30th, 2021

 , 
1Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 척추 동물 분할의 라이브 연구를 가능하게, 제브라피시 후방 체축의 3-D 조직 배양에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 각성 모델은 축 신장, 형태항원 변형, 세포외 분해능 조직 수준 라이브 이미징에 대한 제어를 제공합니다.

Abstract

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척추 동물 배아는 반복적인 솜투, 척추, 근육 및 피부의 선구자로서 주요 신체 축을 패턴으로 합니다. 소마이트는 배아의 꼬리 끝이 후방으로 길게 하는 동안 전소성 중구(PSM)로부터 점진적으로 분과한다. 소미트는 정기적인 주기율과 크기가 크기가 있는 형태를 이룹니다. Zebrafish는 유전적으로 유전적으로 견딜 수 있고 살아있는 화상 진찰을 허용하는 투명한 배아를 가지고 있기 때문에 인기있는 모델 유기체입니다. 그럼에도 불구하고, somitogenesis 동안, 물고기 배아는 크고 둥근 노른자 주위에 싸여 있습니다. 이 기하학은 특히 가까운 객관적인 작업 거리를 필요로 하는 더 높은 해상도에서 제브라피시 배아에 있는 PSM 조직의 살아있는 화상 진찰을 제한합니다. 여기서, 우리는 제브라피시 꼬리 의 살아있는 화상 진찰을 위한 평평한 3-D 조직 배양 방법을 제시합니다. 꼬리 는 축 신장의 비례 감속과 로스트로코달 소미트 길이의 단축을 표시하여 그대로 배아를 모방. 우리는 또한 절제 된 문화를 통해 축 신장 속도를 지연 시킬 수 있습니다. 이를 통해 처음으로 축 신장의 기계성 입력에서 신호 그라데이션의 화학적 입력을 풀 수 있습니다. 향후 연구에서, 이 방법은 약물 침투 우려 없이 시간 조절 된 제약 동요 또는 척추 동물 세분화의 검열을 허용 하기 위해 미세 유체 설정과 결합 될 수 있습니다.

Introduction

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유기체의 메타메황 세분화는 자연에서 널리 사용됩니다. 반복된 구조물은 바디 계획1에서척추, 근육, 신경, 혈관, 사지 및 잎과 같은 측면 기관의 기능에 필수적입니다. 축 대칭의 이러한 생리적 및 기하학적 제약의 결과로, 아네리드, 절지동물 및 그들의 배아 조직의 초다트 전시 세분화와 같은 Bilateria의 대부분의 필라(예: 자궁 절제술, 중음근) antero-후방.

척추 동물 배아는 주 체축을 따라 종별 간격, 개수 및 크기 분포를 가진 솜투로 순차적으로 분사합니다. 종 내의 개별 적인 태아 중 이러한 견고함에도 불구 하 고, somite 세분화는 척추 동물 종 사이 다재 다능 한. 세분화는 시간 간격의 광대 한 정권에서 발생 (제브라피시에서 25 분에서 5 인간의 시간), 크기 (제브라피시의 꼬리 솜톤의 ~ 20 μm에서 ~200 μm 마우스의 트렁크 솜트에서 ~ 200 μm) 및 카운트 (제브라피시 에서 32에서 ~300 옥수수 뱀에 ~ 300)2. 더 흥미롭게도, 물고기 배아는 세분화 간격과 축 신장 속도 모두에 대해 보상하여 적절한 크기 분포로 소크를 그대로 유지하면서 광범위한 온도 (~20.5 °C에서 얼룩말 피시의 경우 34 °C까지)에서 개발....

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Protocol

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이 프로토콜은 1 일 보다 더 젊은 살아있는 척추 동물 태아의 사용을 포함 수정 후 수정. 모든 동물 실험은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 윤리적 지침에 따라 수행되었다; 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 # 2017-0048)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 배아 수집

  1. 배아 수집 일 전날 밤 교차 탱크에 제브라피 쌍을 설정합니다. 배아 발달의 정밀한 준비 제어를 위해 짝짓기 쌍 사이의 장벽을 사용합니다.
  2. 선호하는 산란 시간 전에 장벽을 높이고 100mm 페트리 접시에서 15분 이내에 계란을 수집합니다.
    1. 페트리 접시의 깨끗한 파편. 하나의 클러치에서 50개 이상의 배아를 수집하는 경우 클러치를 여러 페트리 접시로 나눕히면 그에 따라 분리합니다.
  3. 어필 스테이지(5시간 후 수정)에 도달할 때까지 28°C의 물고기 계통 물에서 배아를 배양합니다. E3와 같은 표준화된 배아 성장 배지는 3.2단계까지 수족관 시스템 물 대신에도 사용할 수 있다.
    1. 스테레오스코프 하에서 수정되지 않은 계란을 제거하고 배아를 하룻밤 동안 23.5 °C 인큐베이터로 이동시다(O/N). 배아는 수집 일 다음 날 아침에 8-10 somites....

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Results

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이 프로토콜은 살아있는 제브라피시 꼬리 의 평평한 기하학적 배양이 가능합니다. 조직 배양은 전체 배아에 비해 세 가지 주요 장점을 제시합니다: 1) 축 신장 속도의 제어, 2) 간단한 해부에 의한 다양한 신호(morphogen) 소스에 대한 제어, 3) 거의 목표, 높은 배율 및 높은 NA 라이브 이미징.

화학적으로 처리되지 않은 슬라이드 챔버는 꼬리가 그 아래 조직 주위에 감싸는 피부 자궁 절제술에 의해 그것의 주요 축(도 2A)을길게 하는 것을 허용합니다. 화학적으로 활성화된 슬라이드 챔버(유형 I 콜라겐)에서 이종을 배양했을 때, 피부 이포더름은 슬라이드 챔버에 뻗어 부착되어 축 연수를 중단시켰습니다. 그럼에도 불구하고, 솜씨는 세그먼트를 계속했다(그림 2B,보충 영화 S1 과 S2). 프로토콜에 설명된 바와 같이, 축 신장은 장착 공정 .......

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Discussion

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이 문서는 우리가 개발하고 제브라피시 배아를 위해 최근에 사용 된 조직 배양 각기 기술의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리의 기술은 병아리8과 제브라피시9,10,11 모델 유기체의 이전 각성 방법에 기반을 두고 있습니다. 이 프로토콜로 준비된 꼬리 이식은 간단한 슬라이드 챔버에서 >12h만큼 살아남을 수 있으며, 주요 신체 축을 계속 길게 하고 솜을 분할하는 것은 소미발생이 끝날 때까지 지속됩니다.

치료 건강 하 고 성공적으로 긴 긴 긴 기간을 유지 하기 위해 주어져야 한다. 첫째, 조직 축출은 후부 조직의 손상성을 손상시키지 않고 해부되어야합니다. 우리는 피부 세포가 후방 꼬리 부동으로 유입되는 신경 mesodermal 전두엽.......

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Disclosures

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저자는 아무 것도 공개하고 이해 상충을 선언할 수 없습니다.

Acknowledgements

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AECOM Zebrafish 코어 시설과 신시내티 아동 수의학 서비스, 기술 지원을 위한 신시내티 어린이 이미징 코어, 디다르 사파로프(Didar Saparov) 비디오 제작 지원, 원고 편집을 위한 한나 씨월에게 감사드립니다. 이 간행물에서 보고된 연구는 E.M.Ö에 상 번호 R35GM140805에 국가의 건강 연구소의 일반 의학 과학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1mL Sub-Q 주사기(PrecisionGlide NeedleBecton, Dickinson and Co. 포함)배아 및 조작 제거를 위한REF 309597
200 Proof Ethanol, 면역을 위한Decon Labs2701
(100×)조직 해부 매체 용Sigma-AldrichA5955
무수 염화칼슘, 분말해부 매체 용Sigma-Aldrich499609
Dimethylsulfoxide면역 염색Sigma-AldrichD5879
일회용 메스, # 10 스테인레스 스틸Integra-MiltexMIL4-411테이프 슬라이드 웰
준비 용 에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)시그마-알드리치886-86-2(선택 사항) 20개 이상의 조직
소 태아 혈청(FBS)배양 매체용ThermoFisherA3160601
항마우스 IgG2b, Alexa Fluor 594InvitrogenCat#A-21145; RRID:
위한 L-글루타민(페놀 없는 L-글루타민)을 사용한 L-15 배지GIBCO21083-027조직 해부 매체용
메탄올시그마-알드리치179337
미세수술 각막 나이프 2.85mm 앵글 팁 더블 베벨 블레이드외과 전문 분야72-2863조직 해부용
마우스 단클론 안티-ppERK시그마-알드리치Cat#M8159; RRID:ppERK 면역염색용
AB_477245 NucRed Live 647 ReadyProbes 시약InvitrogenR37106(옵션) 세포핵
파라포름알데히드 분말의 라이브 염색을 위한 분말, 95%Sigma-Aldrich158127면역염색용 샘플 고정용
쥐꼬리 콜라겐 코팅 솔루션Sigma-Aldrich122-20(옵션) 슬라이드 챔버 화학적으로 활성화하기 위한
스테이지 탑 인큐베이터Tokai Hittokai-hit-stxg(옵션) 라이브 이미징 중 온도 제어용
투명 테이프 3/4''테이프슬라이드 웰 준비용S-9782
Triton X-100Sigma-AldrichX100면역염색용
Tween 20Sigma-AldrichP1379
제브라피쉬: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)캠벨 외 al., 2015ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4핵 국소화 EGFP를 가진 형질전환
물고기 제브라피쉬: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)Cooper et al., 2005ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75세포막 국소화 EGFP를 가진 형질전환 물고기
염색 항생제 항진균 용액무수 조직 용 마취 단계 조직 추가 염소 조직 해부 매체를 면역염색을 위한 AB_2535781 2차 항체 면역염색용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
  2. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
  3. Westerfield, M.

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