질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.
단백질의 고차 구조를 특성화하는 것은 그 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 질량 분석법 (MS)는 특히 전통적인 방법으로 연구하기 어려운 단백질 시스템을 위해이 목적을위한 강력한 도구로 부상했습니다. MS에 의해 단백질의 구조를 연구하기 위해 단백질의 구조적 정보를 질량에 인코딩하는 용액에서 특정 화학 반응이 수행됩니다. 특히 효과적인 한 가지 접근법은 용매접근 가능한 아미노산 측망을 공유적으로 수정하는 시약을 사용하는 것입니다. 이러한 반응은 프로테오리스틱 소화 및 탠덤 질량 분광과 결합될 때 잔류물 수준의 해상도로 국소화될 수 있는 질량 증가로 이어집니다. 여기에서는 MS 검출과 함께 공유 라벨링 시약으로 디틸피로카보네이트(DEPC)를 사용하는 것과 관련된 프로토콜을 설명합니다. DEPC는 평균 단백질에 잔류물의 최대 30%까지 라벨을 부착할 수 있는 고전기분자로, 우수한 구조적 분해능을 제공한다. DEPC는 MS와 함께 β2-마이크로글로불린과 같은 작은 단일 도메인 단백질에 대한 구조적 정보를 단일 클론 항체와 같은 대형 다중 도메인 단백질에 성공적으로 사용하였다.
단백질은 거의 모든 생리 학적 과정에서 필수적인 생체 분자입니다. 단백질이 수행하는 다양한 기능은 그들이 채택하는 구조와 다른 생체 분자와의 상호 작용 때문에 가능합니다. 더 깊은 수준에서 단백질 기능을 이해하려면 생화학 적 및 생물리학적 도구가 이러한 중요한 구조적 특징과 상호 작용을 해명해야합니다. 전통적으로 X선 결정학, 극저온 전자 현미경 검사법 및 핵 자기 공명(NMR) 분광기는 단백질 구조를 드러내기 위해 원하는 원자 수준의 세부 사항을 제공했습니다. 그러나, 수많은 단백질 시스템은 가난한 결정화 행동, 제한된 단백질 가용성, 과도한 샘플 이질성 또는 분자량 제한 때문에 이러한 기술에 의해 심문될 수 없습니다. 따라서 이러한 한계를 극복하는 새로운 분석 방법이 등장했습니다. 단백질 구조 정보를 제공할 수 있는 새로운 기술 중에는 질량 분석법이 있습니다.
질량 분석법(MS)은 분자의 질량 대전(m/z) 비율을 측정하므로 단백질의 질량에 원하는 구조 정보를 인코딩하여 단백질 고차 구조 정보를 얻어야 합니다. 이 정보를 인코딩하기 위한 몇 가지 접근법이 개발되었으며, 여기에는 수소-중수소 교환(HDX)1,2,3,4,화학적 교차연결(XL)5,6,및 공유 라벨링(CL)7,8,9,10을포함한다. HDX에서 백본 아마이드 수소는 용매 접근성 및 H 결합 정도에 의존하는 비율로 약간 더 대규모 중음판으로 교환됩니다. HDX의 범위는 질량 분광계에 의해 이러한 단편을 분리하고 측정하기 전에 펩티드 단편으로 단백질을 빠르게 소화하거나 하향식 실험에서 단백질을 해리시킴으로써 국소화될 수 있다. 교환 속도를 결정하는 것은 단백질 역학에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. HDX는 백 교환과 관련된 과제와 재현성을 극대화하기 위한 특수 장비의 필요성에도 불구하고 단백질 구조를 특성화하는 데 유용한 도구로 입증되었습니다. XL-MS에서 단백질은 주어진 단백질 내 또는 두 단백질 사이 인접한 잔류물 측사슬을 공유적으로 연결하는 양기능 시약으로 반응합니다. 이를 통해 XL-MS는 단백질 구조를 특성화하는 데 사용할 수 있는 거리 제약조건을 제공할 수 있습니다. 교차 연결된 단백질의 영역은 액체 크로마토그래피(LC)-MS 분석 뒤에 단백질 분해성 소화에 의해 확인될 수 있다. XL-MS는 내부 세포를 포함하여 다양한 단백질 복합체를 연구하는 데 사용되어 온 다목적 도구이지만 XL 제품의 식별은 어렵고 특수 소프트웨어가 필요합니다.
CL-MS는 단백질 구조와 상호 작용을 연구하기 위하여 상호 보완적이고 때때로 대체MS 기지를 둔 공구로 최근에 등장했습니다. CL-MS에서 단백질 또는 단백질 복합체는 용매 에 노출된 측망(도1)과반응할 수 있는 모노 기능 시약으로 공유적으로 변형된다. 상이한 조건하에서 단백질 또는 단백질 복합체의 변형 정도를 비교함으로써, 형태 변화, 결합 부위 및 단백질 단백질 계면이 드러나게 될 수 있다. CL 반응 후, 현장별 정보는 종종 단일 아미노산 수준에서 단백질이 프로테오틸리티로 소화되고, 펩티드 단편이 LC에 의해 분리되고, 변형된 부위가 탠덤 MS(MS/MS)를 사용하여 식별되는 전형적인 상향식 프로테오믹스 워크플로우를 사용하여 얻을 수 있다. 바이오콩주게이트 화학의 풍부한 역사는 CL-MS 실험에 사용할 수있는 수많은 시약을 만들었습니다. CL 시약은 (i) 특정 및 (ii) 비특이적 두 가지 일반적인 범주로 나뉩니다. 특정 시약은 단일 기능 군(예: 무료아민)8,10과 반응하여 구현하기 쉽지만 제한된 구조 정보를 제공하는 경향이 있다. 비특이적 시약은 광범위한 측면 사슬과 반응하지만, 종종 레이저 나 싱크로트론 소스와 같은 특수 장비가 이러한 반응성 종을 생산해야합니다. 하이드록실 라디칼은 하이드록실 라디칼 발자국(HRF)7,11,12,13실험에서 다양한 조건하에서 다양한 단백질 및 단백질 복합체를 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 비특이적 시약이다.
우리의 연구 그룹은 성공적으로 CL-MS 실험의 맥락에서 단백질 구조 및 상호 작용을 연구하기 위해 영양 hylpyrocarbonate (DEPC)라는 또 다른 상대적으로 비특이적 시약을 사용하였다14,15,16,17,18,19,21,22, 23,24,24,25. DEPC는 특정 라벨링 시약의 단순성(즉, 반응을 수행하기 위해 특수 장비가 필요하지 않습니다)을 제공하며 평균 단백질에서 아미노산의 최대 30%와 반응합니다. 고전기성 시약으로서 DEPC는 시스테인, 히스티딘, 라이신, 티로신, 세린 및 투레오닌 잔류물의 N-terminus 및 뉴클레오필측사슬에 반응할 수 있습니다. 전형적으로, 이러한 반응의 단일 생성물이 생성되어 72.02 Da의 질량 증가가 발생합니다. 이 단일 유형의 제품은 단백질이 하이드록실 라디칼7과반응할 때 생성될 수 있는 최대 55가지 제품과 대조된다. 이러한 간단한 화학은 라벨이 부착 된 사이트의 식별을 용이하게합니다.
여기에서, 우리는 단백질 구조 및 상호 작용을 공부하기 위하여 DEPC 기지를 둔 CL-MS를 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 시약 제제, DEPC 단백질 반응, 단백질 소화 조건, LC-MS 및 MS/MS 파라미터 및 데이터 분석과 관련된 세부 사항이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 단백질 금속, 단백질 리간드 및 단백질 단백질 상호 작용뿐만 아니라 가열 시 구조적 변화를 겪고있는 단백질의 예제 결과를 제공하여 DEPC 라벨링의 유용성을 입증합니다.
중요한 단계
신뢰할 수 있는 라벨링 결과를 보장하기 위해 실험 설계에 관한 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 단백질 라벨링을 최대화하기 위해, DEPC와 반응하고 라벨링 범위를 낮출 수 있기 때문에 강력한 뉴클레오필성 그룹(예를 들어, Tris)을 가진 완충을 피할 필요가 있다. 또한 이러한 버퍼가 라벨이 부착된 잔류물로 반응하여 라벨을 제거하여 구조 정보의 손실을 초래할 수 있?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 그랜트 R01 GM075092에서 건강의 국립 연구소 (NIH)의 지원을 인정합니다. 여기에 설명된 데이터 중 일부를 취득하는 데 사용되는 열 궤도 랩 퓨전 질량 분광계는 국립 보건 원 보조금 S10OD010645의 기금으로 획득되었습니다.
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |