질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.
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방법 논문
질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
단백질의 고차 구조를 특성화하는 것은 그 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 질량 분석법 (MS)는 특히 전통적인 방법으로 연구하기 어려운 단백질 시스템을 위해이 목적을위한 강력한 도구로 부상했습니다. MS에 의해 단백질의 구조를 연구하기 위해 단백질의 구조적 정보를 질량에 인코딩하는 용액에서 특정 화학 반응이 수행됩니다. 특히 효과적인 한 가지 접근법은 용매접근 가능한 아미노산 측망을 공유적으로 수정하는 시약을 사용하는 것입니다. 이러한 반응은 프로테오리스틱 소화 및 탠덤 질량 분광과 결합될 때 잔류물 수준의 해상도로 국소화될 수 있는 질량 증가로 이어집니다. 여기에서는 MS 검출과 함께 공유 라벨링 시약으로 디틸피로카보네이트(DEPC)를 사용하는 것과 관련된 프로토콜을 설명합니다. DEPC는 평균 단백질에 잔류물의 최대 30%까지 라벨을 부착할 수 있는 고전기분자로, 우수한 구조적 분해능을 제공한다. DEPC는 MS와 함께 β2-마이크로글로불린과 같은 작은 단일 도메인 단백질에 대한 구조적 정보를 단일 클론 항체와 같은 대형 다중 도메인 단백질에 성공적으로 사용하였다.
서론
단백질은 거의 모든 생리 학적 과정에서 필수적인 생체 분자입니다. 단백질이 수행하는 다양한 기능은 그들이 채택하는 구조와 다른 생체 분자와의 상호 작용 때문에 가능합니다. 더 깊은 수준에서 단백질 기능을 이해하려면 생화학 적 및 생물리학적 도구가 이러한 중요한 구조적 특징과 상호 작용을 해명해야합니다. 전통적으로 X선 결정학, 극저온 전자 현미경 검사법 및 핵 자기 공명(NMR) 분광기는 단백질 구조를 드러내기 위해 원하는 원자 수준의 세부 사항을 제공했습니다. 그러나, 수많은 단백질 시스템은 가난한 결정화 행동, 제한된 단백질 가용성, 과도한 샘플 이질성 또는 분자량 제한 때문에 이러한 기술에 의해 심문될 수 없습니다. 따라서 이러한 한계를 극복하는 새로운 분석 방법이 등장했습니다. 단백질 구조 정보를 제공할 수 있는 새로운 기술 중에는 질량 분석법이 있습니다.
질량 분석법(MS)은 분자의 질량 대전(m/z) 비율을 측정하므로 단백질의 질량에 원하는 구조 정보를 인코딩하여 단백질 고차 구조 정보를 얻어야 합니다. 이 정보를 인코딩하기 위한 몇 가지 접근법이 개발되었으며, 여기에는 수소-중수소 교환(HDX)1,2,
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프로토콜
1. 단백질 및 시약 제제
참고: 이 프로토콜에는 DEPC로 단백질을 라벨링하기 위한 예제 워크플로우가 포함됩니다. 나열된 일부 조건 및 시약 농도는 선택의 단백질에 따라 다를 수 있습니다.
- 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브에 모든 시약 솔루션을 준비합니다.
- pH 7.4에서 10mM 3-(N-morpholino)의 프로파네설포닉산(MOPS) 완충제에서, 일반적으로 수십 개의 μM 범위에서 원하는 농도의 단백질 용액을 준비한다. 대안적으로, 샘플이 DEPC로 반응할 뉴클레오필성 완충제가 포함되어 있는 경우 10mM pH 7.4 MOPS에서 완충교환 기존 단백질 용액을 준비한다. 다른 완충제(예를 들어, 인산염 완충식식염)도 뉴클레오필성 기능성 단이 없는 한 사용될 수 있다.
- 주식 6.9 M DEPC 용액의 1.45 μL을 ACN의 98.55 μL로 파이프하여 건조 아세토닐릴(ACN)으로 100mM DEPC 용액을 준비한다.
참고: 최적의 농도는 그의 및 Lys 잔기23의수에 따라 추정될 수 있더라도, 모든 단백질과 함께 작동할 농도의 아무도 세트가 없습니다. 예를 들어, 50 μM β2-마이크로글로불린 용액의 50 μL을 사용하여, 이 일반적....
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결과
DEPC 수정 사이트 식별 및 수정 비율
공유 라벨링에 의한 질량 첨가는 (a) 그대로 단백질 및 (b) 펩티드 수준8,9에서측정될 수 있다. 그대로 수준에서, 라벨의 다른 수를 가진 단백질 종의 분포는 표지된 단백질 샘플의 직접 분석 또는 LC-MS에서 얻을 수 있다. 고해상도 구조 정보(즉, 사이트 별 라벨링 데이터)를 얻으려면 펩타이드 수준에서 측정을 수행해야 합니다. 라벨링 및 담금질 단계 후, 표지된 단백질은 상향식 프로테오믹 분석(즉, 이황화 감소, 알킬루션, 프로테오리션 소화 및 LC-MS/MS)를 받습니다. 도 3은 DEPC 표지된 부위가 어떻게 식별되고 그들의 변형 수준이 단백질 β-2-마이크로글로불린(β2m)21에대한 DEPC CL-MS 실험에 대해 계산되는지를 나타낸다. MS/MS는 표지된.......
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토론
중요한 단계
신뢰할 수 있는 라벨링 결과를 보장하기 위해 실험 설계에 관한 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 단백질 라벨링을 최대화하기 위해, DEPC와 반응하고 라벨링 범위를 낮출 수 있기 때문에 강력한 뉴클레오필성 그룹(예를 들어, Tris)을 가진 완충을 피할 필요가 있다. 또한 이러한 버퍼가 라벨이 부착된 잔류물로 반응하여 라벨을 제거하여 구조 정보의 손실을 초래할 수 있다고 생각할 수 있습니다. MOPS를 버퍼로 사용하는 것이 좋지만 인산염 완충식식염도 작동합니다. 둘째, 디티오트리톨은 이 시약의 프리 티올이 라벨이 부착된 잔류물로 반응하고 DEPC 수정을 제거할 수 있기 때문에 이황화물 결합의 감소를 피해야 한다. 이 같은 화학은 무료 Cys가 단백질 내 라벨 스크램블링33을일으킬 수 있기 때문에 감소 된 이황화물을 알킬 하는 것이 필수적입니다. 셋째, imidazole를 가진 담금질 단계(Protocol step 2.4)는 라벨링 반응을 중지하는.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 그랜트 R01 GM075092에서 건강의 국립 연구소 (NIH)의 지원을 인정합니다. 여기에 설명된 데이터 중 일부를 취득하는 데 사용되는 열 궤도 랩 퓨전 질량 분광계는 국립 보건 원 보조금 S10OD010645의 기금으로 획득되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 | 밀리포어 시그마 | M1254 | |
| 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 나트륨염 | 밀리포어 시그마 | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 컬럼 | Thermo Scientific | 164537 | 300 μ m x 15cm, C18, 2 μ m, 100 A |
| 아세토니트 | Fisher Scientific | A998-1 | |
| 디에틸피로카보네이 | 밀리포어 시그마 | D5758 | |
| HPLC 등급 물 | 피셔 사이언티픽 | W5-1 | |
| 이미다졸 | 밀리포어 시그마 | I5513 | |
| 고정 키모트립신 | ProteoChem | g4105 | |
| 고정 트립신, TPCK 처리된 | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| 요오도아세트아미드 | 밀리포어 시그마 | I1149 | |
| 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 | 밀리포어 시그마 | C4706 |
참고문헌
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrog....
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재인쇄 및 허가
