우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.
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이 논문에서
요약
초록
점점 더 고령화되는 사회는 신경 퇴행성 질환의 발병률을 증가시킵니다. 지금까지 병리학 적 메커니즘이 부적절하게 이해되어 정의 된 치료법의 확립을 방해합니다. 보호 인자의 발현 증가를 위한 세포 기반 부가 유전자 요법은 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 유망한 옵션으로 간주됩니다. 우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 신경계에서 신경 보호 및 항 혈관 신생 단백질로 특징 지어지는 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자를 1 차 인간 색소 상피 (PE) 세포의 게놈에 안정적으로 발현시키는 방법을 개발했습니다. 일차 PE 세포를 인간 공여자의 눈으로부터 분리하고 배양물에서 유지하였다. 합류점에 도달한 후, 1 x 104 세포를 11 μL의 재현탁 완충액에 현탁시키고, 30 ng의 과민성 SB (SB100X) 트랜스포자제 플라스미드 및 470 ng의 PEDF 트랜스포존 플라스미드를 함유하는 2 μL의 정제된 용액과 합하였다. 유전자 변형은 다음 매개 변수를 사용하여 모세관 전기 천공 시스템으로 수행되었습니다 : 전압 1,100V 및 너비 20ms의 펄스 2 개. 형질감염된 세포를 소 태아 혈청이 보충된 배지를 함유하는 배양 플레이트로 옮겼고; 항생제와 항진균제가 첫 번째 배지 교환과 함께 추가되었습니다. 성공적인 형질감염은 독립적으로 수행된 실험에서 입증되었다. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)은 PEDF 전이유전자의 발현 증가를 보여주었다. PEDF 분비는 면역블로팅에 의해 평가되고, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 정량화된 바와 같이, 유의하게 상승하였고, 안정하게 유지되었다. SB100X 매개 전달은 PE 세포의 게놈에 안정적인 PEDF 유전자 통합을 허용하고 AMD 또는 기타 망막 퇴행성 질환을 치료하기 위한 세포 기반 유전자 추가 요법의 개발에 중요한 PEDF 의 지속적인 분비를 보장했습니다. 더욱이, 인간 PE 세포로의 PEDF 트랜스포존의 통합 프로파일의 분석은 거의 임의의 게놈 분포를 나타내었다.
서론
고령은 신경 퇴행성 질환의 주요 위험으로 설명됩니다. 60세 이상의 환자에서 심각한 시력 상실을 유발하는 다유전자 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)은 실명 및 시력 손상의 가장 흔한 4가지 원인1에속하며 2040년에는 2억 8,800만 명으로 증가할 것으로예상됩니다2. 맥락 모세 혈관과 망막 광 수용체 사이에 위치한 단단히 채워진 세포의 단일 층 인 망막 색소 상피 (RPE)의 기능 장애는 AMD의 발병 기전에 기여합니다. RPE는 정상적인 망막 기능3 에 필수적인 여러 작업을 수행하고 망막과 융모막의 구조적 무결성을 유지하는 데 필수적인 다양한 성장 인자와 인자를 분비하여 광수용체 생존을 지원하고 순환 및 영양소 공급을 위한 기반을 제공합니다.
건강한 눈에서 색소 상피 유래 인자(PEDF)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 효과 균형을 유지하고 세포자멸사로부터 뉴런을 보호하고 내피 세포 증식을 방지하며 모세혈관 내피를 안정화시킵니다. 이동 된 VEGF- 대 -PEDF 비율은 동물 모델 4,5뿐만 아니라 AMD 및 증식 성 당뇨병 성 망막증
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프로토콜
인간 기증자의 눈은 헬싱키 의정서 선언에 따라 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 안과학과의 아헨 각막 은행 (RWTH Aachen 대학 병원)에서 획득했습니다. 인체 시료 수집 및 사용 절차는 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 1차 인간 RPE 세포의 분리
- 멸균 보호 복과 장갑을 배치하십시오. 층류 아래에 멸균 드레이프를 놓습니다.
- 멸균 준비 도구 및 기타 필요한 멸균 장비를 층류 아래에 놓습니다.
- 눈 지구본의 수령, 준비 시작 및 가능한 이상을 기록하십시오. 기증자의 나이, 성별, 사망 원인 및 사망 시점과 눈 제거 사이의 기간을 등록하십시오.
- 아이 글로브를 멸균 거즈 압축에 넣고 한 손으로 잡습니다.
- 메스와 여분의 미세한 뾰족한 눈 가위를 사용하여 윤부 뒤쪽으로 약 3.5mm 떨어진 원주 절단으로 앞쪽 세그먼트와 뒤쪽 세그먼트를 분리합니다.
- 후방 세그먼트를 아래쪽으로 기울인 후 대장균 겸자를 사용하여 유리체와 망막을 조심스럽게 제거하십시오.
- 직선 홍채 집게를 사용하여 붕괴된 RPE/choroidea 복합체를 조심스럽게 재배열한 다음 곡선형 홍채 집게로 제자리에 고정합니다.
- 10% 태아 소 혈....
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결과
일차 인간 RPE 세포의 배양 및 전기천공
우리는 동물 기원의 충분한 수의 1차 RPE 세포의 파종이 착색된, 육각형 모양의 세포(36,37,48)의 통합된 단일층으로의 배양 및 성장을 허용한다는 것을 보여주었다. 단단한 접합을 형성하고, 식세포 활성을 나타내고, 시험관 내48에서 특정 마커 유전자를 발현하는 이들의 능력은 생체내에서 망막 색소 상피의 실질적인 작업을 반영한다. 인간 공여자의 눈으로부터 분리된 배양된 1차 RPE 세포는 또한 공여자의 연령(65.3±9.94a, 최소: 49A, 최대: 83a, n=12), 분리 후 부검 시간(37.3±17.0시간, 최소: 16시간, 최대: 68시간, n=12), 및 배양 시간(27.......
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토론
우리 프로젝트에서 우리는 보호 환경의 확립 및 유지를 위한 장기 치료제로 형질감염된 세포를 사용하기 위해 효과적인 인자를 지속적으로 과발현하고 분비하는 유전자 변형 1차 인간 RPE 세포의 비바이러스 생산을 목표로 합니다. 우리는 항 혈관 신생 및 신경 보호 기능을 가진 유비쿼터스 발현 다기능 단백질 인 PEDF를 암호화하는 유전자의 도입을 확립했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 SB100X 트랜스포존 시스템을 사용하여 1차 인간 RPE 세포를 안정적이고 재현성 있게 형질주입하는 데 사용할 수 있습니다. RPE 세포로의 DNA 전달 및 도입은 큐벳 대신 특정 팁을 전기 천공 챔버로 사용하는 피펫 기반 모세관 형질주입 시스템으로 수행됩니다.
후속 형질감염에 사용될 형태학적으로 잘 분화된 세포로 구성된 1차 RPE 배양의 농축은 인간 기증자(연령 및 일반적인 건강 상태) 및 눈의 수령(세포 분리의 사후 시간)과 관련된 여러 요인의 영향을 받습니다. 새로 분리되고 파종.......
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공개 사항
Zoltán Ivics와 Zsuzsanna Izsvák는 SB 트랜스포존 기술에 대한 여러 특허의 발명가입니다.
감사의 글
이 작업은 연구, 기술 개발 및 시연을위한 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램, 보조금 계약 번호 305134의 지원을 받았습니다. Zsuzsanna Izsvák는 유럽 연구위원회 (European Research Council, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742)의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 탁월한 기술 지원을 해준 Anna Dobias와 Antje Schiefer (안과학과, RWTH Aachen 대학 병원 Aachen)와 인간 기증자의 눈을 제공 한 Aachen 각막 은행 (안과학과, 대학 병원 RWTH Aachen)에게 감사드립니다.
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재료
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| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
참고문헌
- James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Wong, W. L., et al.
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