Alle dyreforsøk ble utført under lisensen ZH152/17 i samsvar med standardene og forskriftene til Cantonal Ethics Commission Zurich og EPIC dyreanlegg ved Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich. MERK: Denne protokollen starter med sletting av H19- og IG-DMRs i phaESCs. Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du oppretter phaESC-linjer, kan du se publiserte rapporter10,13. En oversikt over og tidsramme for denne protokollen (trinn 1–14) finnes i figur 1A. medier, løsninger og buffere er oppført i tabell 1. Prosedyren for å etablere DKO-phaESC-linjer (trinn 1–6) vises i figur 1B, og strategien for å konstruere halvkloste embryoer (trinn 7–14) er avbildet i figur 1C. 1. Transfeksjon av plasmider for sletting av H19-DMR og IG-DMR i phaESCs Forbered CRISPR/Cas9-plasmider for samuttrykk av Cas9-nukleaser og guide RNAer for å målrette slettinger av H19-DMR og IG-DMR. Ligate fire par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R oppført i tabell 2) i pX330-plasmider.MERK: Se den publiserte protokollen om den detaljerte prosedyren for fremstilling av disse 4 CRISPR/Cas9-plasmidene14. Alternativt er plasmider tilgjengelig for generelle musestammer også tilgjengelige gjennom et depot (Materialliste). Belegge overflaten av en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml 0,2% gelatinoppløsning ved inkubasjon ved 37 °C i 10 minutter. Plate 2 × 105 wildtype phaESCs på gelatinbelagt brønn i haESC medium uten antibiotika, og inkuber platen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære i 1 dag.MERK: Antibiotika utelates fra mediet for å øke effektiviteten til den påfølgende lipofeksjonen. Vi brukte wildtype phaESCs ved passering 10. Vi anbefaler at du bruker phaESCs for tidlig passasje, men en rekke passasjenummer har blitt brukt8. Sammenhengen mellom passasjenummer og effektivitet for å oppnå halvklostede embryoer og mus er for tiden ikke kjent. Transfekt phaESCs i brønnen av en 6-brønns plate (fra trinn 1.3) med 6 plasmider samtidig ved hjelp av lipofeksjon reagens: 50 ng piggyBac plasmid bærer en CAG-EGFP transgene, 50 ng piggyBac transposase plasmid og 600 ng av hver av de 4 CRISPR/ Cas9 plasmidene (fra trinn 1.1). Se produsentens protokoll om detaljert prosedyre for transfeksjonen.MERK: To piggyBac-plasmider brukes til å integrere en transposon for allestedsnærværende uttrykk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) i genomet til phaESCs. Hvis GFP-merking av cellene ikke er nødvendig, kan disse to plasmidene erstattes av en CRISPR / Cas9-plasmid for forbigående uttrykk for fluorescensproteiner (f.eks. pX458 plasmid) i stedet for en av pX330-plasmidene. Forbigående EGFP-uttrykk kan deretter brukes til sortering av transfekterte celler. To dager etter transfeksjonen aspirerer du mediet og tilsetter 800 μL trypsin. Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter. Tilsett deretter 2 ml vaskebuffer for å slukke trypsin, og pipette flere ganger for å få en enkelt celle suspensjon. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Sentrifuger røret på 160 x g i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspend cellepellet i 400 μL haESC vedlikeholdsbuffer supplert med 15 μg/ml Hoechst 33342.MERK: For å redusere den potensielle toksisiteten til Hoechst 33342, 1 μg/ml Hoechst 33342 og 50 μM verapamil har blitt brukt i stedet for 15 μg/ml Hoechst 3334215. Inkuber cellefjæringen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør celleopphenget til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette, og hold røret ved 4 °C til det er klart til bruk i neste trinn (avsnitt 2). 2. Encellet plating av transfekterte phaESCs ved hjelp av et strømningscytometer En dag før sortering av de transfekterte phaESCs, platebestrålet mus embryonale fibroblaster (MEFs) på gelatinbelagte 96-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF-medium. Vanligvis er 6 plater forberedt på å etablere en phaESC-linje med målrettede slettinger. Inkuber platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.MERK: Bestrålede MEFer er kommersielt tilgjengelige. Vi bruker MEFer avledet fra E12.5 embryoer av DR4 mus. Selv om haESC-er kan vokse på gelatinbelagte plater uten MEF-er, anbefaler vi MEF-er for å øke levedyktigheten til sorterte enkelt-haESCer. På sorteringsdagen aspirerer du MEF-mediet fra 96-brønnsplatene, og tilsetter 120 μL ferskt haESC-medium per brønn. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Sett opp en cellesortering med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner. En 355 nm UV-laser og en 488 nm blå laser brukes til eksitasjon av henholdsvis Hoechst 33342 og EGFP fluorescens.MERK: Alternativt kan Hoechst 33342 oppdages ved eksitasjon med 405 nm. Sorter de transfekterte phaESCene i 5 ml-røret (fra trinn 1.10) ved hjelp av en port for innsamling av haploide celler i G1/S-fasen som viser EGFP-uttrykk. Deponer en enkelt celle i hver brønn av 96-brønnsplatene fra trinn 2.2.MERK: Påvisning av Hoechst 33342 farging skiller vanligvis 3 topper av celler med et 1n, 2n og 4n DNA-innhold, som tilsvarer haploide celler i G1-fase, en blanding av haploide celler i henholdsvis G2 / M-fase og diploide celler i G1-fase og diploide celler i henholdsvis G2 / M-fase. Haploide celler i G1/S fase er identifisert som toppen med lavere intensitet av Hoechst 33342 fluorescens. Et representativt resultat og en sorteringsport vises i Figur 2A. Etter plating, inkubere 96-brønnsplatene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. 3. Sub-kloning av transfected phaESCs Tre dager etter encellet plating kan kolonier observeres i flere brønner av 96-brønnsplatene under et mikroskop. Merk brønnene der bare enkeltkolonier vokser.MERK: Etter vår erfaring ble det observert enkeltkolonier i 20%-40% av brønnene på 96-brønnsplatene. På dag 4 etter encellet plating erstatter halvparten av mediet med nytt haESC-medium i brønnene med enkeltkolonier. En dag før passaging (på dag 4 eller 5 etter encellet plating), bestrålet plate MEFs på gelatinbelagte 96-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Etter 5 eller 6 dager med encellet plating, velg brønner av 96-brønnsplatene som inneholder enkeltkolonier med en diameter større enn 150 μm.MERK: Om lag 100 brønner velges fortrinnsvis for å etablere en phaESC-linje med de målrettede DMR-slettingene. Aspirer mediet i de valgte brønnene og tilsett 30 μL trypsin. Inkuber 96-brønnsplatene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter. Tilsett deretter 30 μL vaskebuffer til hver brønn for å slukke trypsin. Tilsett 140 μL haESC medium i hver brønn, og pipette flere ganger for å oppnå enkeltceller. Aspirer MEF-mediet fra brønnene på de 96 brønnplatene som ble utarbeidet i trinn 3.3. Overfør phaESC-ene fra hver brønn fra trinn 3.6 til en frisk brønn av den nye 96-brønnsplaten fra trinn 3.7. Inkuber 96-brønnsplatene som inneholder phaESC-subkloner ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. På neste dag aspirerer du hele mediet fra hver brønn, og legger til 120 μL nytt haESC-medium. Inkuber platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. En dag før cellene blir flytende for passivring, kan du bestråle de bestrålede MEF-ene på gelatinbelagte 24-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Når phaESCs har blitt sammenfallende for passaging, aspirere mediet og legge til 30 μL trypsin. Inkuber 96-brønnsplatene ved 37 °C i 5 minutter. Tilsett 90 μL vaskebuffer i hver brønn for å slukke trypsin. Pipette flere ganger for å oppnå enkeltceller. Aspirer MEF-mediet fra brønnene på 24-brønnsplatene fra trinn 3,11, og tilsett 600 μL ferskt heESC-medium. Overfør 60 μL av suspensjonen av phaESC subclones fra hver brønn i trinn 3.13 til en ny brønn av 24-brønnsplatene fra trinn 3.14. Hold den gjenværende suspensjonen av hver phaESC subclone for DNA-ekstraksjon og genotyping i trinn 4. Inkuber 24-brønnsplatene med phaESC-subclones ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. En dag før cellekulturene når tettheten for passivitet, kan du bestråle de bestrålede MEF-ene på gelatinbelagte 6-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Når phaESCs blir confluent nok for passaging, aspirere mediet og legge til 250 μL trypsin. Inkuber 24-brønnsplatene ved 37 °C i 5 minutter.MERK: Etter genotyping i trinn 4.9 må bare phaESC-linjer med sletting av både H19-DMR og IG-DMRpasseres. Tilsett 750 μL vaskebuffer i hver brønn for å slukke trypsin. Pipette flere ganger for å oppnå en enkelt celle suspensjon. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 2 ml haESC-medium. Aspirer MEF-mediet fra brønnene på 6-brønnsplatene fra trinn 3.17. Overfør phaESC-fjæringen fra hvert rør fra trinn 3.20 til en ny brønn. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Utvid celleklonene ved å gjenta trinn 3.17 til 3.21 og øke platestørrelsen og volumene av trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Forbered en T25-kolbe for hver underklamerte phaESC-linje med MEFer for trinn 5.MERK: Vi anbefaler å fryse en aliquot av hver sub-klonet phaESC-linje i 300 μL frysemedium og holde en kryostock i flytende nitrogenlagring før du går videre til trinn 5. 4. Første genotyping av sub-klonede phaESC-linjer med MEFer For å trekke ut genomisk DNA fra den gjenværende cellefjæringen fra trinn 3.15, tilsett 200 μL lysisbuffer til hver brønn av 96-brønnsplatene. Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør. Skyll hver brønn med ytterligere 200 μL lysisbuffer for å gjenopprette alle gjenværende celler og samle i samme 1,5 ml rør. Inkuber 1,5 ml-røret ved 55 °C i 3 timer med blanding. Etter inkubasjon, tilsett 460 μL isopropanol til hvert 1,5 ml rør, og bland forsiktig til et DNA-bunnfall blir synlig. Sentrifuger rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Vask DNA-pelletsene med 200 μL 70% etanol. Sentrifuger rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Tørk rørene i luft i 10 min og resuspend deretter DNA i 20 μL vann. Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) ved hjelp av termostabil DNA-polymerase etter produsentens protokoll.MERK: Primerparene for PCR er oppført i tabell 2 og brukes som følger: H19-DMR-P1 og P3 (407 bp for slettet H19-DMR); H19-DMR-P2 og P3 (623 bp for wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 og P3 (319 bp for slettet IG-DMR); IG-DMR-P2 og P3 (492 bp for wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen til PCR for alle primerpar er som følger: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Lengden på forsterkede DNA-fragmenter for H19-DMR- og IG-DMR-slettingene viser en viss variasjon på grunn av ikke-homolog ende sammenføyning assosiert med CRISPR / Cas9-mediert redigering. PhaESCs ble dyrket med MEFer, som inneholder wildtype H19-DMR og IG-DMR DNA. Derfor er primerpar av H19-DMR-P2 /P3 og IG-DMR-P2/P3, som forsterker WILDTYPE DNA-fragmenter, ikke informative. Imidlertid er disse primerparene inkludert som kontroller og bør gi et bånd i alle reaksjoner. Analyser PCR-fragmentene ved agarose gelelektroforese. Se den publiserte protokollen om den detaljerte prosedyren for elektroforesen16. Identifiser cellelinjer med slettinger av både H19-DMR og IG-DMR. Et representativt bilde av elektroforese er vist i figur 2B.MERK: I vårt tilfelle ble åtte cellelinjer med sletting av både H19-DMR og IG-DMRidentifisert blant 135 underklamerte phaESC-linjer. 5. Haploid cellerensing av sub-klonede phaESC-linjer Når de sub-klonede phaESC-kulturene i T25-kolber fra trinn 3.22 blir tette nok til passivisering, aspirerer du mediet og legger til 1,5 ml trypsin. Inkuber kolben ved 37 °C i 5 minutter. Tilsett deretter 4,5 ml vaskebuffer og pipette flere ganger for å oppnå en encellet suspensjon. Overfør hver cellefjæring til et 15 ml rør og sentrifuger røret ved 160 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellepellets i 400 μL haESC vedlikeholdsbuffer supplert med 15 μg/ml Hoechst 33342. Inkuber cellesuspensjonene ved 37 °C i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør cellesuspensjonene til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette. Skyll cellesilhetten med ytterligere 400 μL heESC vedlikeholdsbuffer, og samle de resterende cellene i samme 5 ml rør. Hold røret ved 4 °C til det er klart til sortering. Sett opp et strømningscytometer med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner.MERK: Hoechst 33342 kan påvises ved eksitasjon ved 405 nm. Her brukes en 355 nm UV-laser til påvisning av Hoechst 33342. Sett opp cellefjæringen (fra trinn 5.3) og et nytt 15 ml rør som inneholder 2 ml heESC-vedlikeholdsbuffer for å samle sorterte celler i strømningscytometeret. Start analysen og sett opp sorteringsporten for å samle haploide celler i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A for å identifisere G1/S fase phaESC-populasjonen.MERK: Noen sub-klonede phaESC-linjer kan ikke inneholde haploide celler på grunn av fullstendig diploidisering eller feilaktig plating av diploide celler i trinn 2. Hvis haploide celler ikke observeres i G1/S-fasen, går du videre til en annen prøve uten å sortere. I vårt tilfelle inneholdt 5 cellelinjer haploide celler og 3 cellelinjer inneholdt bare diploide celler av 8 sub-klonede phaESC-linjer. Etter cellesortering, tilsett 5 ml vaskebuffer langs veggen på 15 ml oppsamlingsrøret. Sentrifuger røret på 160 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Velg en plate av passende størrelse for dyrking avhengig av antall sorterte celler. Bruk en enkelt brønn av en 96-brønnsplate, en 24-brønnsplate og en 12-brønnsplate for å dyrke henholdsvis 1000–40 000 celler, 40 000–200 000 celler og 200 000–400 000 celler. Resuspend cellepellet i henholdsvis 120 μL, 600 μL og 1,2 ml haESC-medium.MERK: Plate cellene med høy tetthet fordi lav sammenløp kan føre til celledød av cellene etter sortering. Fra dette tidspunktet og fremover dyrkes phaESCs på gelatinbelagte brønner uten MEF-er for å lette genotyping i trinn 6 og den påfølgende anvendelsen for intracytoplasmisk injeksjon fra trinn 9. Etter å ha overført cellefjæringen til en gelatinbelagt brønn av riktig størrelse, inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Fortsett å utvide phaESC-kulturene ved å gjenta trinn 3.18 til 3.21 med økende platestørrelser og økende mengder trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Cellene dyrkes på gelatinbelagte brønner uten MEF-er. For hver sub-klonede phaESC-linje, lag en kultur i en brønn på en 24-brønnsplate og en brønn av en 6-brønns plate for henholdsvis trinn 6 og 9.MERK: Noen celler i hver underklamet phaESC-linje skal fryses i 300 μL frysemedium som kryostock i en flytende nitrogenlagringstank før du går videre til trinn 9. 6. Andre genotyping av underklamerte phaESC-linjer uten MEFer MERK: En andre runde med genotyping utføres for å bekrefte at de sub-klonede phaESC-linjene har slettinger av både H19- og IG-DMRs, og at wildtype-alleler er fraværende etter fjerning av MEFer. Bekreft under mikroskopet at kulturene i brønnene på 24-brønnsplatene fra trinn 5.11 er fri for MEF-er.MERK: Hvis MEFer blir observert, er det nødvendig å fortsette å passere kulturene til MEF-er har forsvunnet for å unngå å forurense PCR med wildtype DNA fra MEFer. Aspirer mediet fra samløpskulturer og tilsett 400 μL lysisbuffer per brønn av 24-brønnsplaten. Etter pipettering flere ganger, overfør cellefjæringen til et 1,5 ml rør. Inkuber 1,5 ml-røret ved 55 °C i 3 timer med blanding. Etter inkubasjon, tilsett 400 μL isopropanol til 1,5 ml-røret, og bland forsiktig til et DNA-bunnfall blir synlig. Sentrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Vask DNA-pelletsen med 200 μL 70% etanol. Sentrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Tørk røret i luft i 10 min og resuspend deretter DNA i 50 μL vann. Utfør genotyping PCR etter trinn 4.7 og gel elektroforese i trinn 4.8 for å identifisere cellelinjer, som har slettinger av både H19- og IG-DMRs og er fri for wildtype alleler.MERK: Et bilde av en typisk andre genotypingsanalyse vises i figur 2B som referanse. I vårt tilfelle var alle de 5 cellelinjene som ble valgt etter haploid cellerensing (trinn 5) fri for wildtype-alleler og hadde bare slettingsgatene til H19- og IG-DMRs. Bruk de sub-klonede phaESC-linjene som er valgt etter denne andre genotypingen som DKO-phaESC-linjer. 7. Superovulation av mus For produksjon av MII oocytter, initiere superovulation ved intraperitoneal injeksjon av 5 IE av gravid mare serum gonadotropin (PMSG) løsning i hver B6D2F1 kvinnelig mus (4-5 uker gammel) 63-65 h før oocytt samling.MERK: B6D2F1-musestammen anbefales for denne protokollen fordi B6D2F1 oocytter tolererer intracytoplasmisk injeksjon godt og viser høyt utviklingspotensial etter prosedyren17. Førtiåtte timer etter PMSG injeksjon, intraperitoneally injisere 5 IE av human chorion gonadotropin løsning i hver mus. 8. Oocyte-kolleksjon Forbered en 4-brønns plate som inneholder 700 μL hyaluronidasemedium i en brønn og 700 μL M2 medium i de resterende 3 brønnene. I tillegg tilberedes en 6 cm tallerken med 7 ml M2 medium og en midtbrønnfat med 900 μL M16 medium. Forvarm tallerkenen og rettene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. På dagen for den intracytoplasmatiske injeksjonen, euthanize superovulated kvinner (fra trinn 7.2) av enten Cervical dislocation eller CO2 inhalasjon på rundt 8 AM om morgenen. Disseker oviduktene ved hjelp av pinsett og saks. Plasser oviduktene i den 6 cm lange retten med M2-medium. Slipp cumulus-oocyttkompleksene (COC) ved å rive ampulla av oviduktene med en 30 G nål. Overfør COC-er til forvarmet hyaluronidasemedium og hold den ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Etter 2–3 min samler du cumulusfrie oocytter med munnpipette og vasker oocyttene 3 ganger ved å overføre dem til ferskT M2-medium i de andre 3 brønnene på 4-brønnsplaten. Samle metafase II (MII) oocytter, som har første polare kropper, i en midtbrønnrett med M16 medium og hold platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære til bruk for intracytoplasmatisk injeksjon i trinn 12. 9. Behandling og innsamling av DKO-phaESCs Forbered en DKO-phaESC-kultur i en brønn på en 6-brønnsplate uten MEFer ved 60-80% samløp en dag før den intracytoplasmatiske injeksjonen (fra trinn 5.11). For å indusere cellesyklusstans i M-fase, aspirer mediet helt og tilsett 2 ml haESC-medium som inneholder 0,05 mg/ml demecolcin. Etter 8 h demecolcin behandling, aspirere mediet og tilsett 800 μL trypsin. Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter, tilsett deretter 2 ml vaskebuffer for å slukke trypsinet, og pipette flere ganger for å oppnå en encellet suspensjon. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten. Resuspend cellepellet i 400 μL heESC vedlikeholdsbuffer som inneholder 15 μg/ml Hoechst 33342. Inkuber cellefjæringen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør cellefjæringen til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette, og hold røret ved 4 °C til cellesorteringen i trinn 10. 10. Rensing av M-fase-arresterte DKO-phaESCs Sett opp et strømningscytometer med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner.MERK: Hoechst 33342 kan påvises ved eksitasjon ved 405 nm. Her brukes en 355 nm UV-laser til påvisning av Hoechst 33342. Sett opp M-fase-arresterte DKO-phaESCs fra trinn 9.7 og start analysen. Velg en passende sorteringsport for innsamling av haploide M-faseceller (2n) fra prøven som behandles med demecolcin.MERK: Etter demecolcin behandling forventes 2 cellepopulasjoner, tilsvarende haploid og diploid M-fase-arresterte celler som vist i figur 3B. Cellesyklusstansen etter demecolcin behandling er fullført, og dermed observeres ingen haploid 1n DNA-topp. Dette er viktig ettersom de haploide M-fasecellene og diploide G1-cellene har samme DNA-innhold (2n) og vil produsere overlappende topper. Sett opp et 15 ml rør som inneholder 2 ml heESC-vedlikeholdsbuffer for å samle de sorterte cellene i strømningscytometeret. Start cellesortering. Etter cellesortering, tilsett 5 ml vaskebuffer langs veggen av oppsamlingsrøret. Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten. Resuspend cellene i et passende volum av haESC vedlikeholdsbuffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 x 105 celler / ml. Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør. Hold røret på is til det er klart for intracytoplasmatisk injeksjon i trinn 12. 11. Fremstilling av holde- og mikroinjeksjonspipetter MERK: For å utføre den intracytoplasmatiske injeksjonen (trinn 12) er det nødvendig med flere holde- og mikroinjeksjonspipetter (figur 4A). Disse pipettene kan kjøpes på skreddersydd etterspørsel fra en kommersiell leverandør eller laget av egnede glasskapillærer ved hjelp av en mikropipettetrekker og en mikroforge. Trekk borosilikatglass kapillærer på en mikropipettetrekker. For å trekke borosilikatglass kapillærer uten filament (0,78 x 1,00 x 80 mm) er følgende parametere gitt for en flammende horisontal trekker (Tabell over materialer) som referanse, men vil variere for andre instrumenter og glass kapillærtyper: Varme 510 (Rampetest 480), Trekk 0, Hastighet 150, Tid 175 og Trykk 200 for å holde pipetter; Heat 510 (Rampetest 480), Trekk 90, Hastighet 140, Tid 125 og Trykk 200 for mikroinjeksjonspipetter.MERK: De optimale parametrene må defineres individuelt fordi flere faktorer, inkludert fuktighet, modellen til en mikropipettetrekker og mange glasskapillærer, kan påvirke formen på injeksjonspipettene. En langstrakt form med en gradvis kon bør være rettet mot. Forberedelse av holdepipetter Sett en trukket kapillær tilberedt i trinn 11.1 til en mikroforge. Plasser kapillæren over glassperlen på filamentet og senk kapillæren for å få kontakt med glassperlen mens du varmer opp filamentet. Bryt kapillæren ved å slå av oppvarmingen og løsne fra glassperlen slik at den ytre diameteren er 60-100 μm. Plasser kapillærspissen horisontalt for å vende mot glassperlen på filamentet. Varm filamentet slik at den indre diameteren på kapillærspissen smelter til en diameter på 10-20 μm. Flytt kapillæren slik at glassperlen plasserer seg på et punkt ~ 1 mm fra kapillærspissen uten kontakt. Varm opp filamentet slik at kapillæren kan bøye seg i en 20° vinkel. Demonter kapillæren, kalt en holdepipette, fra mikroforgen.MERK: For å måle størrelsen på kapillæren, er det fortrinnsvis installert et okular-retitel i mikroforgen. Fremstilling av mikroinjeksjonspipetter Sett en trukket kapillær tilberedt i trinn 11.1 til en mikroforge. Plasser kapillæren over glassperlen på filamentet og senk kapillæren for å få kontakt med glassperlen mens du varmer opp filamentet. Bryt kapillæren ved å slå av oppvarmingen og løsne fra glassperlen i en posisjon som den ytre diameteren er 6 μm. Flytt kapillæren slik at glassperlen plasserer seg på et punkt ~ 1 mm fra kapillærspissen uten kontakt. Varm opp filamentet slik at kapillæren kan bøye seg oppover i en 20° vinkel. Demonter mikroinjeksjonspipetten fra mikroforberederen og oppbevar den i en sikker boks for senere bruk.MERK: Mikroinjeksjonspipettene er tilberedt med følgende spesifikasjoner: ytre diameter, 6 μm; indre diameter, 4,5-5 μm; bøyevinkel, 20°. Å definere den optimale utformingen av mikroinjeksjonspipetten er viktig for suksessen til den intracytoplasmatiske injeksjonen. For stor indre diameter kan forhindre brudd på plasmamembranen til donor-DKO-phESC-ene (se diskusjonsseksjonen). Hvis den indre diameteren er for smal, kan det hindre jevn pipettering av donor-DKO-phESC-ene. En bøyevinkel < 30° er å foretrekke, da en høy bøyevinkel hindrer effekten av piezopulser. 12. Intracytoplasmisk injeksjon av DKO-phaESCs Før den intracytoplasmatiske injeksjonen (fra trinn 12.2), lag en polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning ved å legge 5 ml M2 medium inn i et 50 ml rør som inneholder 0,6 g PVP og agitating røret på en rocker ved 4 °C i 2 dager. Etter at PVP er oppløst helt, er løsningen sterilfiltrert og lagret ved 4 °C. På dagen for den intracytoplasmatiske injeksjonen, lag en senter-brønnrett med 900 μL KSOM medium og forvarm parabolen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Forbered en mikromanipuleringsfat ved å justere dråper på 5 μL PVP-oppløsning og 20 μL M2 medium på et lokk på en 10 cm tallerken som er plassert opp-ned. Dekk dråpene med mineralolje, og legg parabolen på injeksjonsmikroskopets stadium.MERK: Det anbefalte arrangementet av mikromanipuleringsfatet er vist i figur 4B. Monter en holderpipette på mikromanipulatoren. Fyll mikroinjeksjonspipetten med fluorokarbonoljen ved hjelp av en mikroloaderspiss, og monter den på piezo-aktuatoren. Senk mikroinjeksjonspipetten ned i en dråpe med PVP-oppløsning og pipette opp og ned flere ganger for å belegge glasset med PVP og gjøre det mindre klebrig. Last et lite volum PVP-løsning inn i mikroinjeksjonspipetten, og flytt pipetten til en dråpe med M2-medium. Senk pipetten ned i M2-mediet, og fokuser på pipetten i bunnen av dråpen. Overfør ca. 2 μL DKO-phaESC-suspensjon fra trinn 10,6 til M2-mediumfallet. Overfør 10 MII oocytter fra trinn 8.5 til samme M2 medium drop ved hjelp av en munnpipette. For injeksjon roterer du en oocytt i M2 medium-dråpen slik at perivitellinerommet vender mot mikroinjeksjonspipetten, og MII-platen er ikke plassert i banen til mikroinjeksjonspipetten (Figur 4A). Hold oocytten ved å påføre negativt trykk gjennom holdepipetten.MERK: En MII-plate identifiseres visuelt som et fremspring av ooplasma som kalles en “pukkel” og ofte ligger ved siden av den første polare kroppen. MII-platen inneholder den meiotiske spindelen med vedlagte kromosomer. Berøring av mikroinjeksjonspipetten og MII-platen må unngås, da mekanisk skade på spindelen og kromosomene kan forstyrre embryoutviklingen. Legg en DKO-phaESC i spissen av mikroinjeksjonspipetten ved å påføre forsiktig negativt trykk. Sprekk plasmamembranen til en DKO-phaESC ved pipettering for å unngå injeksjon av en intakt DKO-phaESC (Figur 3C; se diskusjon).MERK: I tilfelle plasmamembranen til en DKO-phaESC ikke brister ved pipettering, kast DKO-phaESC og last inn en annen DKO-phaESC. Plasser mikroinjeksjonspipetten i kontakt med oocyttens zona pellucida, og påfør en liten mengde negativt trykk i mikroinjeksjonspipetten. Påfør piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) for å bryte gjennom zonaen mens du skyver spissen av mikroinjeksjonspipetten mot perivitellinerommet. Kontroller at MII-platen, som inneholder en spindel og kromosomer, ikke er plassert i banen til mikroinjeksjonspipetten.MERK: Juster innstillingen empirisk til de laveste piezopulsene for boring gjennom zonaen for å minimere muligheten for skade på oolemmaen. Kast fragmentet av zona pellucida fra mikroinjeksjonspipetten, og plasser DKO-phaESC på kanten av pipetten. Penetrer oocytten med mikroinjeksjonspipetten slik at oolemmaen når motsatt side.MERK: Ikke berør MII-platen for å unngå skade på spindelen og kromosomene. Påfør en piezopuls (intensitet, 6; frekvens, 1) for å pierce oolemmaen. Pass på at oolemmaen slapper av langs mikroinjeksjonspipettens skaft.MERK: Empirisk definere den laveste innstillingen av piezo puls for å bryte oolemma for å minimere skaden på oocytten. Injiser DKO-phaESC med et minimalt volum medium i ooplasma, og trekk mikroinjeksjonspipetten jevnt ut av oocytten. Løsne den injiserte oocytten fra holderpipetten, og plasser den på siden av mikrodråpen for senere innsamling. Gjenta injeksjonsprosedyren fra trinn 12,9 til 12,17 for de andre MII-oocyttene i M2-mediumfallet.MERK: Unngå å holde oocyttene ute av inkubatoren i mer enn 20 minutter. Etter vår erfaring kan en gruppe på 10 oocytter manipuleres komfortabelt innen 15 minutter etter passende trening. Overfør batchen med injiserte oocytter fra M2 medium drop til en forvarmet senterbrønnrett med KSOM-medium. Oppbevar retten i 1 time ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Gjenta oocyttmanipuleringen fra trinn 12,5 og 12,20 med flere grupper MII-oocytter for å få nok injiserte oocytter. 13. Aktivering av konstruerte halvkloste embryoer Forbered to senter-brønn retter med 900 μL hver av KSOM medium og aktiveringsmedium. Forbered en 4-brønns plate med 700 μL KSOM medium i hver brønn. Forvarm oppvasken og tallerkenen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Etter 1 time i KSOM-medium overfører du de injiserte oocyttene fra trinn 12.21 til den forvarmede midtbaneretten med aktiveringsmedium. Oppbevar retten i 6 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære for aktivering. Etter aktivering, observere noen semi-klonede embryoer danner tre polare kropper, som er den første og den andre polare kroppen av oocytten, og pseudo polar kroppen fra DKO-phaESC (Figur 3E). Vask embryoene 3 ganger ved å overføre dem til nye brønner med KSOM-medium i en 4-brønns plate. Overfør embryoene inn i midtbrønnretten med KSOM-medium, og hold parabolen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære for videre utvikling. 14. Utvikling av konstruerte halvkloste embryoer Etter 1 kulturdag i KSOM-medium fra trinn 13.6, når flere halvkloste embryoer 2-cellersstadiet (Figur 5A). For videreutvikling av preimplantasjonsembryoer in vitro, fortsett å dyrke de halvkloste embryoene i KSOM-medium ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Overfør de semi-klonede embryoene til friskt KSOM-medium på dag 2. På dag 4 vil flere embryoer nå blastocyststadiet (Figur 5A). For avledning av halv klonede mus, overfør 2-cellers embryoer fra trinn 14.1 til oviduktene til pseudo-gravide mottakerhunner. Identifiser pseudo-gravide kvinner ved parring til vasektomiserte menn en dag før embryooverføringen og velg dem på grunnlag av tilstedeværelsen av en tydelig synlig plugg om morgenen på dagen for embryooverføring (0,5 dager etter coitum (dpc)). Rundt 19,5 dpc leveres fulltids valper naturlig fra mottakerhunner (Figur 5B).