将RatWalker系统应用于帕金森病遗传大鼠模型中的步态分析
Summary
在这里，我们描述了RatWalker系统，该系统是通过重新设计MouseWalker设备来构建的，以适应增加的老鼠的尺寸和重量。该系统使用受挫全内反射 （FTIR）、高速视频捕获和开放式访问分析软件来跟踪和量化步态参数。
Abstract
帕金森病 （PD） 是一种进行性神经退行性疾病，由黑质致密部多巴胺能 （DA） 神经元丢失引起。步态异常，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步数缩短，在帕金森病患者中很常见，并且出现在病程早期。因此，PD动物模型中运动模式的定量对于病程和治疗期间的表型表征非常重要。大多数PD病例是特发性的;然而，PD遗传形式的鉴定揭示了基因突变和变异，例如Pink1和Parkin的功能丧失突变，这两种蛋白质参与线粒体质量控制，可以用来创建动物模型。虽然小鼠在失去Pink1和Parkin（单次和组合缺失）时对神经变性具有抵抗力，但在大鼠中，Pink1而不是Parkin缺乏导致黑质DA神经元丧失和运动障碍。在这里，我们报告了FTIR成像的效用，以揭示自由行走的年轻（2个月大）雄性大鼠的步态变化，随着这些大鼠年龄的增长（在4-6个月时观察到），其特征是后肢拖曳，如先前在Pink1敲除（KO）大鼠中报道的那样。
Introduction
PD是最常见的年龄相关性神经退行性运动障碍，是由黑质致密体中DA神经元的缺失引起的。这种黑质DA神经元的缺失和进入纹状体的DA输入导致PD1，2患者观察到的运动功能障碍。帕金森病患者的运动特征（统称为帕金森综合征）包括强直、静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和显微照片3。此外，步态障碍在PD患者中很常见，出现在疾病早期1，4，5。虽然建议采取某些生活方式来帮助减缓PD的进展，例如健康饮食和定期运动，但目前尚无治愈PD的方法，只有药物来控制症状。这为进一步研究留下了空间，以期改进治疗方法。因此，PD动物模型中步态模式的表征是表征模型相关性以及旨在控制PD的治疗如何预防或改善运动障碍的关键工具。
有各种PD动物模型已被用于测试治疗，但是每种模型都有其局限性。例如，用神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）处理的动物模型已经产生了大量关于对黑质DA神经元缺失和随后的纹状体适应很重要的过程的信息，并指出线粒体在PD发病机制中的作用;然而，MPTP模型的致病背景具有毒性，而不是像人类PD6那样的神经退行性过程。其他化学诱导模型包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）和鱼藤酮。6-OHDA是第一种通过药物在DA神经元中的选择性积累来诱导PD的药物，最终杀死神经元并导致PD样症状。该模型首先用于通过检查对苯丙胺和阿扑吗啡的反应来跟踪DA耗竭7。这种PD诱导方法已被证明可用于筛选影响DA及其受体的药物8。虽然6-OHDA模型是跟踪可量化运动缺陷的一个很好的模型，但该模型并未显示神经元的逐渐丧失和路易体的形成如何影响动物。另一种诱导方法鱼藤酮已被证明具有黑质纹状体神经元的进行性变性，酪氨酸羟化酶和DA转运蛋白的丢失，从而允许更好的模型来跟踪神经元随时间的损失9。鱼藤酮处理的大鼠表现出运动迟缓，姿势不稳定和步态不稳10。然而，已经发现这种方法在不同品系的大鼠之间差异很大，这引发了对鱼藤酮是否是可靠的PD模型的质疑11，12，13。虽然步态分析已被证明受到大鼠PD诱导的影响，但迄今为止，遗传诱导的PD大鼠模型尚未通过自由走在跑道上轻松用于步态分析。
分析自由行走的啮齿动物运动障碍的一种方法是运动学步态分析，可以通过利用FTIR成像进行。这种既定方法使用基于FTIR的光学触摸传感器，该传感器记录和跟踪啮齿动物在跑道14，15，16上移动时的脚印。与其他方法相比，FTIR不依赖于动物身体上任何可能干扰爪印的标记。视频数据的生成产生所有四个肢体的数字爪印，可以组合在一起，为各种啮齿动物模型创建动态且可重复的行走模式。基于成像的步态分析的原理是，当啮齿动物走下跑道时，取下每只爪子并测量随时间推移的接触面积。每种姿势都由爪面积的增加（在制动阶段）和爪面积的减少（在推进阶段）表示。这是通过摆动阶段进行的，即没有检测到爪子信号时。在对视频进行评估后，将生成几个参数，可用于比较野生型（WT）与PD模型。参数的一些示例包括步长（爪子一步覆盖的距离）、摆动持续时间（爪子不与跑道接触的时间持续时间）、摆动速度（步长与摆动持续时间的函数）和步型（对角线步、横向步长或腰带步）。
为了证明FTIR在揭示大鼠早期步态模式变化方面的效用，我们使用了PD的遗传大鼠模型。虽然大多数PD病例是特发性的;PD遗传形式的鉴定发现了基因突变和变异，例如Pink1和Parkin的功能丧失突变，这两种蛋白质参与线粒体质量控制17，可以用来创建动物模型18。不幸的是，小鼠在失去这些蛋白质（单一和组合）时对神经变性具有抗性19，20，21。在大鼠中，Pink1而不是Parkin缺乏导致黑质DA神经元丢失和运动障碍22，但没有完全外显。因此，我们生成了一个组合的Pink1 / Parkin双敲除（DKO）大鼠模型，该模型显示了雄性Pink1 KO大鼠22中报告的明显视觉上明显的后肢拖曳表型，但现在的比率更高：100%对4-6个月之间的雄性30-50%。
虽然这种方法适用于分析小鼠14的运动缺陷，但FTIR成像步态系统规格以适应大鼠的大小和体重以前是非商业性的。在这里，我们解释了如何构建RatWalker，这是一种以MouseWalker14为模型的改进的FTIR步态成像系统，除了适应老鼠的大小和体重。该系统利用光学效应FTIR提供了一种可视化并随后记录动物足迹以进行分析的方法。动物的脚与光波导（平台）接触会导致光路中断，从而产生可见的散射效应，这是使用家用级高速摄像和使用开源软件进行处理的。这项研究证明了FTIR成像在研究PD遗传大鼠模型中步态变化方面的能力。例如，虽然最早在雄性DKO大鼠4个月时观察到明显的视觉上明显的运动变化（即后肢拖拽），但使用FTIR，我们能够在2个月大时发现雄性DKO大鼠的门异常。
Protocol
Representative Results
Discussion
步态障碍，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步数缩短，是帕金森病的一个决定性特征，发生在病程早期1，5。多年来，已经开发了几种方法来观察和记录脚步，以便在PD的啮齿动物模型中进行步态分析，手动技术用于量化脚步位置，从而产生了更灵敏且能够捕获动态参数的自动化方法。一些静态方法涉及“墨迹”啮齿动物的爪子，并带有指示器，以?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS和HF感谢Michael J Fox帕金森研究基金会对他们在帕金森病方面的工作的支持。
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
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| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
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| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
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| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
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| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
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| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
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| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
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