파킨슨병의 유전적 쥐 모델에서 보행 분석을 위한 RatWalker 시스템 적용
Summary
여기에서는 쥐의 증가된 크기와 무게를 수용하기 위해 MouseWalker 장치를 재설계하여 구축된 RatWalker 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 좌절된 전체 내부 반사(FTIR), 고속 비디오 캡처 및 오픈 액세스 분석 소프트웨어를 사용하여 보행 매개변수를 추적하고 정량화합니다.
Abstract
파킨슨 병 (PD)은 흑질의 도파민 성 (DA) 뉴런의 손실로 인한 진행성 신경 퇴행성 장애입니다. 팔 스윙 감소, 느린 보행 속도 및 짧은 걸음을 포함한 보행 이상은 PD 환자에게 흔하며 질병 초기에 나타납니다. 따라서, PD의 동물 모델에서 운동 패턴의 정량화는 질병 경과 동안 및 치료 치료시 표현형 특성화에 중요 할 것이다. PD의 대부분의 경우는 특발성입니다. 그러나 PD의 유전 적 형태의 확인은 동물 모델을 만드는 데 활용할 수있는 미토콘드리아 품질 관리에 관여하는 두 가지 단백질 인 Pink1 및 Parkin의 기능 상실 돌연변이와 같은 유전자 돌연변이 및 변이를 발견했습니다. 마우스는 Pink1 및 Parkin (단일 및 복합 결실)의 손실시 신경 퇴행에 내성이있는 반면, 쥐에서는 Parkin 결핍이 아닌 Pink1이 흑질 DA 뉴런 손실 및 운동 장애를 유발합니다. 여기에서, 우리는 Pink1 녹아웃 (KO) 쥐에서 이전에보고 된 바와 같이 뒷다리 끌림을 특징으로하는 Pink1과 Parkin의 결합 손실이 있기 전에 Pink1과 Parkin의 결합 손실이있는 자유롭게 걷는 어린 (2 개월) 수컷 쥐의 보행 변화를 밝히기위한 FTIR 이미징의 유용성을보고합니다 (4-6 개월에 관찰).
Introduction
가장 흔한 연령 관련 신경 퇴행성 운동 장애 인 PD는 흑질에서 DA 뉴런의 손실로 인해 발생합니다. 이러한 nigral DA 뉴런의 손실과 선조체로의 DA 입력은 PD 1,2 환자에서 관찰된 운동 기능 장애로 이어집니다. 파킨슨증으로 통칭되는 PD 환자의 정의 운동 특성에는 강직, 휴식 떨림, 서맥증, 자세 불안정 및 현미경 사진이포함됩니다3. 또한, PD 환자에서 흔히 볼 수 있는 보행 장애는 질병 1,4,5의 진행 초기에 나타납니다. 건강한 식습관과 규칙적인 운동과 같이 PD의 진행을 늦추는 데 도움이 되는 특정 생활 방식이 제안되지만 현재 PD에 대한 치료법은 없으며 증상을 관리하는 약물만 있습니다. 이것은 개선 된 치료법을 희망하는 추가 조사의 필요성을 남깁니다. 따라서 PD 동물 모델에서 보행 패턴의 특성화는 모델의 관련성뿐만 아니라 PD를 제어하기위한 치료 치료가 운동 장애를 예방하거나 개선하는 방법을 특성화하는 중요한 도구입니다.
치료 치료를 테스트하는 데 사용 된 다양한 PD 동물 모델이 있지만 각각에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 신경독 1- 메틸 -4- 페닐 -1,2,3,6- 테트라 하이드로 피리딘 (MPTP)으로 처리 된 동물 모델은 니그랄 DA 뉴런 손실 및 후속 선조체 적응에 중요한 과정에 대한 풍부한 정보를 산출했으며, PD 발병 기전에서 미토콘드리아의 역할을 지적했다. 그러나, MPTP 모델의 병리학적 배경은 인간PD6에서와 같이 신경변성 과정이라기보다는 독성인 성질을 갖는다. 추가의 화학적 유도성 모델에는 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 및 로테논이 포함됩니다. 6-OHDA는 DA 뉴런에 약물을 선택적으로 축적하여 PD를 유도하기 위해 사용된 최초의 제제였으며, 이는 결국 뉴런을 죽이고 PD와 유사한 증상을 유발합니다. 이 모델은 암페타민과 아포 모르핀7에 대한 반응의 행동을 조사하여 DA 고갈을 추적하는 데 처음 사용되었습니다. PD 유도의이 방법은 DA 및 그의 수용체8에 영향을 미치는 약리학 적 제제의 스크리닝에 유용한 것으로 입증되었다. 6-OHDA 모델은 정량화 가능한 운동 결함을 추적하기위한 훌륭한 모델이지만,이 모델은 뉴런의 점진적인 손실과 Lewy 신체의 형성이 동물에게 어떤 영향을 미치는지 보여주지 않습니다. 유도의 다른 방법인 로테논은 티로신 하이드록실라제 및 DA 수송체의 손실과 함께 흑질선조체 뉴런의 점진적인 퇴행을 갖는 것으로 나타났으며,이는 시간 경과에 따른 뉴런의 손실을 추적하는 더 나은 모델을 허용합니다9. 로테논 처리된 래트는 서맥운동증, 자세 불안정, 및 불안정한 보행10을 보였다. 그러나,이 방법은 쥐의 상이한 균주간에 광범위하게 가변적 인 것으로 밝혀졌으며, 이는 로테 논이 신뢰할 수있는 PD 모델11,12,13인지 여부에 대한 의문을 불러 일으켰다. 보행 분석은 쥐에서 PD의 유도에 의해 영향을받는 것으로 나타 났지만, 현재까지 유 전적으로 유도 된 PD 쥐 모델은 활주로를 자유롭게 걸어 보행 분석에 쉽게 사용되지 않았습니다.
자유롭게 걷는 설치류의 운동 장애를 분석하는 한 가지 방법은 FTIR 이미징을 활용하여 수행 할 수있는 운동 학적 보행 분석입니다. 이 확립 된 방법은 FTIR을 기반으로 한 광학 터치 센서를 사용하며, 설치류가 활주로(14,15,16)를 따라 이동할 때 발자국을 기록하고 추적합니다. 다른 방법과 비교하여 FTIR은 발자국을 방해 할 수있는 동물 신체의 마커에 의존하지 않습니다. 비디오 데이터의 생성은 다양한 설치류 모델에 대한 역동적이고 재현 가능한 보행 패턴을 생성하기 위해 결합될 수 있는 4개의 팔다리 모두의 디지털 발자국을 생성합니다. 이미징 기반 보행 분석의 원리는 설치류가 활주로를 걸어 내려갈 때 각 개별 발을 잡고 시간이 지남에 따라 접촉 면적을 측정하는 것입니다. 각 자세는 발 면적의 증가 (제동 단계에서)와 발바닥 면적의 감소 (추진 단계에서)로 표시됩니다. 이것은 발바닥 신호가 감지되지 않는 스윙 단계에 의해 진행됩니다. 비디오 평가 후 야생형(WT) 대 PD 모델을 비교하는 데 사용할 수 있는 여러 매개변수가 생성됩니다. 매개변수의 몇 가지 예는 스텝 길이(발이 한 스텝에서 커버하는 거리), 스윙 지속시간(발이 활주로와 접촉하지 않는 시간), 스윙 속도(스윙 지속시간의 함수로서의 스텝 길이) 및 스텝 패턴(대각선 스텝, 측면 스텝 또는 거들 스텝)입니다.
쥐의 초기 보행 패턴 변화를 밝히기위한 FTIR의 유용성을 입증하기 위해 PD의 유전 적 쥐 모델을 사용했습니다. PD의 대부분의 경우는 특발성입니다. PD의 유전적 형태의 확인은 동물 모델18을 만드는 데 활용될 수 있는 미토콘드리아 품질 관리17에 관여하는 두 단백질인 Pink1 및 Parkin의 기능 상실 돌연변이와 같은 유전자 돌연변이 및 변이체를 밝혀냈습니다. 불행히도, 마우스는 이러한 단백질 (단일 및 조합)의 손실시 신경 퇴행에 내성이 있습니다 19,20,21. 쥐에서 Pink1은 파킨 결핍이 아니지만 흑질질 DA 뉴런 손실 및 운동 장애22를 유발하지만 완전한 침투는 없습니다. 따라서 우리는 결합 된 Pink1 / Parkin 이중 녹아웃 (DKO) 쥐 모델을 생성했는데, 이는 수컷 Pink1 KO 쥐22에서보고 된 명백한 시각적으로 명백한 뒷다리 끌림 표현형을 표시하지만 지금은 더 높은 비율로 나타납니다 : 100-30 개월 사이에 남성의 50-4 % 대 6 %.
이 방법은 마우스14의 운동 결손을 분석하는 데 효과적이지만, 쥐의 크기와 무게를 수용하기위한 FTIR 이미징 보행 시스템 사양은 이전에는 비상업적으로 사용할 수 없었습니다. 여기에서는 쥐의 크기와 무게에 맞게 조정된 것을 제외하고 MouseWalker14를 모델로 한 수정된 FTIR 보행 이미징 시스템인 RatWalker를 구축하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 광학 효과 FTIR을 사용하여 분석을 위해 동물 발자국을 시각화하고 이후에 기록하는 방법을 제공합니다. 동물의 발이 광 도파관(플랫폼)과 접촉하면 광 경로가 중단되어 가시적인 산란 효과가 발생하며, 이는 국내 등급의 고속 비디오 촬영 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용한 처리를 사용하여 캡처됩니다. 이 연구는 PD의 유전 적 쥐 모델에서 보행 변화를 연구 할 때 FTIR 영상의 힘을 보여줍니다. 예를 들어, 빠르면 4 개월에 수컷 DKO 쥐에서 명백한 시각적 운동 변화 (즉, 뒷다리 끌림)가 관찰되는 반면, FTIR을 사용하면 생후 2 개월에 수컷 DKO 쥐의 게이트 이상을 발견 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
팔 스윙 감소, 느린 보행 속도 및 짧은 단계를 포함한 보행 장애는 PD의 특징이며 질병 과정 1,5 초기에 발생합니다. PD의 설치류 모델에서 보행 분석을위한 발자국을 관찰하고 기록하기 위해 수년에 걸쳐 여러 가지 방법이 개발되었으며, 발자국 위치를 정량화하는 수동 기술은 더 민감하고 동적 매개 변수를 캡처 할 수있는 자동화 된 접근 방식으로 이어?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS와 HF는 파킨슨 병 연구에 대한 연구를 지원 한 Michael J Fox Foundation for Parkinson ‘s Research에 감사드립니다.
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
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| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
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| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
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| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
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| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
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| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
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| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
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