Aplicación del sistema RatWalker para el análisis de la marcha en un modelo genético de ratas de la enfermedad de Parkinson

Summary

Aquí describimos el sistema RatWalker, construido mediante el rediseño del aparato MouseWalker para adaptarse al aumento de tamaño y peso de las ratas. Este sistema utiliza reflexión interna total frustrada (FTIR), captura de video de alta velocidad y software de análisis de acceso abierto para rastrear y cuantificar los parámetros de la marcha.

Abstract

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo causado por la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra pars compacta. Las anomalías de la marcha, que incluyen disminución del balanceo del brazo, velocidad de marcha más lenta y pasos más cortos son comunes en pacientes con EP y aparecen temprano en el curso de la enfermedad. Por lo tanto, la cuantificación de los patrones motores en modelos animales de EP será importante para la caracterización fenotípica durante el curso de la enfermedad y durante el tratamiento terapéutico. La mayoría de los casos de EP son idiopáticos; sin embargo, la identificación de formas hereditarias de EP descubrió mutaciones y variantes genéticas, como mutaciones de pérdida de función en Pink1 y Parkin, dos proteínas involucradas en el control de calidad mitocondrial que podrían aprovecharse para crear modelos animales. Mientras que los ratones son resistentes a la neurodegeneración tras la pérdida de Pink1 y Parkin (deleción única y combinada), en ratas, la deficiencia de Pink1 pero no Parkin conduce a la pérdida de neuronas DA nigral y deterioro motor. Aquí, informamos la utilidad de las imágenes FTIR para descubrir cambios en la marcha en ratas macho jóvenes (2 meses de edad) que caminan libremente con pérdida combinada de Pink1 y Parkin antes del desarrollo de una anomalía motora aparente visual a medida que estas ratas envejecen (observada a los 4-6 meses), caracterizada por arrastre de las extremidades posteriores como se informó anteriormente en ratas Pink1 knockout (KO).

Introduction

La EP, el trastorno neurodegenerativo del movimiento más común relacionado con la edad, es causada por la pérdida de neuronas DA en la sustancia negra pars compacta. Esta pérdida de neuronas DA nigral y las entradas de DA en el cuerpo estriado conducen a las alteraciones de la función motora observadas observadas en pacientes con EP ^1,2. Las características motoras definitorias de los pacientes con EP, conocidas colectivamente como parkinsonismo, incluyen rigidez, temblor en reposo, bradicinesia, inestabilidad postural y micrografía³. Además, las alteraciones de la marcha, que son comunes en pacientes con EP, aparecen temprano en el curso de la enfermedad ^1,4,5. Si bien se sugieren ciertos estilos de vida para ayudar a retrasar la progresión de la EP, como una alimentación saludable y ejercicio regular, actualmente no existe una cura para la EP, solo medicamentos para controlar los síntomas. Esto deja espacio para la necesidad de más investigación con la esperanza de mejorar la terapéutica. Por lo tanto, la caracterización del patrón de marcha en modelos animales de EP es una herramienta crucial para caracterizar la relevancia del modelo, así como la forma en que los tratamientos terapéuticos dirigidos a controlar la EP están previniendo o mejorando las deficiencias motoras.

Hay varios modelos animales de EP que se han utilizado para probar tratamientos terapéuticos, sin embargo, cada uno tiene sus limitaciones. Por ejemplo, los modelos animales tratados con la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) han proporcionado una gran cantidad de información sobre procesos importantes para la pérdida de neuronas DA nigral y las posteriores adaptaciones estriatales, y han señalado el papel de las mitocondrias en la patogénesis de la EP; sin embargo, el fondo patogénico del modelo MPTP es de naturaleza tóxica más que un proceso neurodegenerativo como en la EP^{humana 6}. Los modelos adicionales inducibles químicamente incluyen 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y rotenona. 6-OHDA fue el primer agente utilizado para inducir la EP por acumulación selectiva del fármaco en las neuronas DA, que eventualmente mata las neuronas y conduce a síntomas similares a la EP. Este modelo se utilizó por primera vez para el seguimiento del agotamiento de DA mediante el examen del comportamiento en respuesta a la anfetamina y la apomorfina⁷. Este método de inducción de DP ha demostrado ser útil para el cribado de agentes farmacológicos que impactan la DA y sus receptores⁸. Si bien el modelo 6-OHDA es un gran modelo para rastrear déficits motores cuantificables, este modelo no muestra cómo la pérdida gradual de neuronas y la formación de cuerpos de Lewy afectan al animal. El otro método de inducción, la rotenona, ha demostrado tener una degeneración progresiva de las neuronas nigroestriatales con la pérdida de tirosina hidroxilasa y transportador DA, lo que permite un mejor modelo para rastrear la pérdida de neuronas a lo largo del tiempo⁹. Las ratas tratadas con rotenona mostraron bradicinesia, inestabilidad postural y marcha inestable¹⁰. Sin embargo, se ha encontrado que este método es ampliamente variable entre las diferentes cepas de ratas, lo que ha provocado el cuestionamiento de si la rotenona es o no un modelo confiable de DP^11,12,13. Si bien se ha demostrado que el análisis de la marcha se ve afectado por la inducción de la EP en ratas, hasta la fecha, los modelos de ratas con EP inducidos genéticamente no se han utilizado fácilmente para el análisis de la marcha caminando libremente por una pista.

Una forma de analizar el deterioro motor en roedores que caminan libremente es el análisis cinemático de la marcha, que se puede realizar utilizando imágenes FTIR. Este método establecido utiliza un sensor táctil óptico basado en FTIR, que registra y rastrea las huellas de los roedores a medida que avanzan por la pista^14,15,16. En comparación con otros métodos, FTIR no depende de ningún marcador en el cuerpo del animal que pueda interferir con las huellas de las patas. La generación de los datos de video produce huellas digitales de las cuatro extremidades que se pueden combinar para crear un patrón de marcha dinámico y reproducible para varios modelos de roedores. El principio del análisis de la marcha basado en imágenes es tomar cada pata individual y medir el área de contacto a lo largo del tiempo a medida que el roedor camina por la pista. Cada postura está representada por un aumento en el área de la pata (en la fase de frenado) y una disminución en el área de la pata (en la fase de propulsión). Esto es precedido por la fase de oscilación, que es cuando no se detecta ninguna señal de pata. Después de la evaluación del video, se generan varios parámetros que se pueden usar para comparar el tipo salvaje (WT) con el modelo PD. Algunos ejemplos de los parámetros son la longitud del paso (distancia que cubre la pata en un solo paso), la duración del giro (duración del tiempo que la pata no está en contacto con la pista), la velocidad del giro (longitud del paso en función de la duración del giro) y el patrón de paso (pasos diagonales, pasos laterales o pasos de faja).

Para demostrar la utilidad de FTIR para descubrir cambios tempranos en el patrón de marcha en ratas, utilizamos un modelo genético de EP en ratas. Si bien la mayoría de los casos de EP son idiopáticos; la identificación de formas hereditarias de EP descubrió mutaciones y variantes genéticas, como mutaciones de pérdida de función en Pink1 y Parkin, dos proteínas involucradas en el control de calidad mitocondrial¹⁷, que podrían aprovecharse para crear modelos animales¹⁸. Desafortunadamente, los ratones son resistentes a la neurodegeneración tras la pérdida de estas proteínas (simples y combinadas)19,20,21. En ratas, la deficiencia de Pink1 pero no de Parkin conduce a la pérdida de neuronas DA nigral y alteraciones motoras²², pero sin penetrancia completa. Por lo tanto, generamos un modelo combinado de rata Pink1 / Parkin double knockout (DKO), que muestra el fenotipo de arrastre de extremidades posteriores visualmente aparente reportado en ratas macho Pink1 KO²² pero ahora a una tasa más alta: 100% versus 30-50% de los machos entre 4-6 meses.

Si bien este método funciona bien para analizar déficits motores en ratones¹⁴, las especificaciones del sistema de marcha de imágenes FTIR para acomodar el tamaño y el peso de las ratas anteriormente no estaban disponibles de manera no comercial. Aquí explicamos cómo construir el RatWalker, un sistema de imágenes de marcha FTIR modificado modelado a partir del MouseWalker¹⁴, excepto adaptado para el tamaño y peso de las ratas. Este sistema utiliza un efecto óptico, FTIR, para proporcionar un método para visualizar y posteriormente registrar huellas de animales para su análisis. El contacto del pie de un animal con la guía de onda óptica (plataforma) causa una interrupción en la trayectoria de la luz, lo que resulta en un efecto de dispersión visible, que se captura utilizando videografía de alta velocidad de grado doméstico y procesamiento utilizando software de código abierto. Este estudio demuestra el poder de las imágenes FTIR en el estudio de los cambios en la marcha en modelos genéticos de ratas de EP. Por ejemplo, mientras que los cambios motores evidentes visualmente evidentes (es decir, el arrastre de las extremidades posteriores) se observan en ratas DKO macho a los 4 meses como muy pronto, utilizando FTIR podemos descubrir anomalías en la puerta en ratas DKO macho a los 2 meses de edad.

Protocol

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Nebraska (IACUC). 1. Aparatos de marcha NOTA: Modelado a partir del MouseWalker14, el RatWalker fue diseñado con dimensiones proporcionales a la diferencia en la longitud del paso entre ratas y ratones. Consiste en una retroiluminación de iluminación lateral, recinto de pasarela, pasarela de guía …

Representative Results

Mantenimiento de colonias de ratasLa generación y caracterización de ratas KO individuales Pink1 y Parkin ha sido descrita previamente22. Las ratas KO individuales Pink1 y Parkin se obtuvieron de SAGE Labs (y ahora están disponibles en Envigo). Las ratas DKO se generaron cruzando ratas Pink1-/- con ratas Parkin-/- para obtener ratas Pink1+/-/Parkin+/-, que se cruzaron para obtener ratas Pink1-/-/Parkin-<…

Discussion

Las alteraciones de la marcha, incluyendo disminución del balanceo del brazo, velocidad de marcha más lenta y pasos más cortos, son una característica definitoria de la EP y ocurren temprano durante el curso de la enfermedad ^1,5. A lo largo de los años se han desarrollado varios métodos para observar y registrar pisadas para el análisis de la marcha en modelos de EP con roedores, con técnicas manuales para cuantificar la posición de pisada que conducen a…

Materials

Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” – 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1