Het ratwalkersysteem toepassen voor loopanalyse in een genetisch rattenmodel van de ziekte van Parkinson
Summary
Hier beschrijven we het RatWalker-systeem, gebouwd door het MouseWalker-apparaat opnieuw te ontwerpen om tegemoet te komen aan de toegenomen grootte en het gewicht van ratten. Dit systeem maakt gebruik van gefrustreerde totale interne reflectie (FTIR), snelle video-opname en open-access analysesoftware om loopparameters te volgen en te kwantificeren.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening veroorzaakt door het verlies van dopaminerge (DA) neuronen in de substantia nigra pars compacta. Loopafwijkingen, waaronder verminderde armzwaai, langzamere loopsnelheid en kortere stappen komen vaak voor bij PD-patiënten en verschijnen vroeg in het verloop van de ziekte. De kwantificering van motorische patronen in diermodellen van PD zal dus belangrijk zijn voor fenotypische karakterisering tijdens het ziekteverloop en bij therapeutische behandeling. De meeste gevallen van PD zijn idiopathisch; de identificatie van erfelijke vormen van PD onthulde echter genmutaties en varianten, zoals functieverliesmutaties in Pink1 en Parkin, twee eiwitten die betrokken zijn bij mitochondriale kwaliteitscontrole die kunnen worden gebruikt om diermodellen te maken. Terwijl muizen resistent zijn tegen neurodegeneratie bij verlies van Pink1 en Parkin (enkelvoudige en gecombineerde deletie), leidt Pink1 maar niet Parkin-deficiëntie bij ratten tot nigral DA-neuronverlies en motorische stoornissen. Hier rapporteren we het nut van FTIR-beeldvorming om loopveranderingen te ontdekken bij vrij lopende jonge (2 maanden oud) mannelijke ratten met gecombineerd verlies van Pink1 en Parkin voorafgaand aan de ontwikkeling van grof visueel zichtbare motorische afwijking naarmate deze ratten ouder worden (waargenomen op 4-6 maanden), gekenmerkt door achterste slepen zoals eerder gemeld bij Pink1 knockout (KO) ratten.
Introduction
PD, de meest voorkomende leeftijdsgebonden neurodegeneratieve bewegingsstoornis, wordt veroorzaakt door het verlies van DA-neuronen in de substantia nigra pars compacta. Dit verlies van nigrale DA-neuronen en de DA-inputs in het striatum leiden tot de waargenomen motorische functiestoornissen die worden waargenomen bij patiënten met PD 1,2. De bepalende motorische kenmerken van patiënten met PD, gezamenlijk bekend als Parkinsonisme, omvatten stijfheid, rusttremor, bradykinesie, houdingsinstabiliteit en micrografie3. Bovendien verschijnen loopstoornissen, die vaak voorkomen bij PD-patiënten, vroeg in het verloop van ziekte 1,4,5. Hoewel bepaalde levensstijlen worden voorgesteld om de progressie van PD te vertragen, zoals gezond eten en regelmatige lichaamsbeweging, is er momenteel geen remedie voor PD, alleen medicijnen om de symptomen te beheersen. Dit laat ruimte voor de noodzaak van verder onderzoek in de hoop op verbeterde therapieën. Karakterisering van het looppatroon in PD-diermodellen is dus een cruciaal hulpmiddel om de relevantie van het model te karakteriseren, evenals hoe therapeutische behandelingen gericht op het beheersen van PD motorische stoornissen voorkomen of verbeteren.
Er zijn verschillende PD-diermodellen die zijn gebruikt om therapeutische behandelingen te testen, maar elk heeft zijn beperkingen. Diermodellen behandeld met het neurotoxine 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) hebben bijvoorbeeld een grote schat aan informatie opgeleverd over processen die belangrijk zijn voor nigral DA-neuronverlies en daaropvolgende striatale aanpassingen, en wezen op de rol van mitochondriën in PD-pathogenese; de pathogenetische achtergrond van het MPTP-model is echter van toxische aard in plaats van een neurodegeneratief proces zoals bij pd6 bij de mens. Aanvullende chemisch induceerbare modellen omvatten 6-hydroxydopamine (6-OHDA) en rotenon. 6-OHDA was het eerste middel dat werd gebruikt om PD te induceren door selectieve accumulatie van het medicijn in de DA-neuronen, wat uiteindelijk de neuronen doodt en leidt tot PD-achtige symptomen. Dit model werd voor het eerst gebruikt voor het volgen van DA-depletie door het gedrag te onderzoeken als reactie op amfetamine en apomorfine7. Deze methode van PD-inductie is nuttig gebleken voor de screening van farmacologische middelen die DA en zijn receptoren beïnvloeden8. Hoewel het 6-OHDA-model een geweldig model is voor het volgen van kwantificeerbare motorische tekorten, laat dit model niet zien hoe het geleidelijke verlies van neuronen en de vorming van Lewy-lichamen het dier beïnvloeden. Van de andere inductiemethode, rotenon, is aangetoond dat het progressieve degeneratie van nigrostriatale neuronen heeft met het verlies van tyrosinehydroxylase en DA-transporter, waardoor een beter model mogelijk is om het verlies van neuronen in de loop van de tijd te volgen9. De met rotenon behandelde ratten vertoonden bradykinesie, houdingsinstabiliteit en onstabiele gang10. Deze methode blijkt echter sterk variabel te zijn tussen verschillende stammen van ratten, wat de vraag heeft opgeroepen of rotenon al dan niet een betrouwbaar PD-model is 11,12,13. Hoewel is aangetoond dat loopanalyse wordt beïnvloed door de inductie van PD bij ratten, zijn genetisch geïnduceerde PD-rattenmodellen tot op heden niet gemakkelijk gebruikt voor loopanalyse door vrij over een landingsbaan te lopen.
Een manier om motorische stoornissen bij vrij lopende knaagdieren te analyseren, is kinematische loopanalyse, die kan worden uitgevoerd met behulp van FTIR-beeldvorming. Deze gevestigde methode maakt gebruik van een optische aanraaksensor op basis van FTIR, die de voetafdrukken van de knaagdieren registreert en volgt terwijl ze over de baan bewegen 14,15,16. In vergelijking met andere methoden is FTIR niet afhankelijk van markers op het lichaam van het dier die de pootafdrukken kunnen verstoren. Het genereren van de videogegevens produceert digitale pootafdrukken van alle vier de ledematen die kunnen worden gecombineerd om een dynamisch en reproduceerbaar looppatroon te creëren voor verschillende knaagdiermodellen. Het principe van op beeldvorming gebaseerde loopanalyse is om elke individuele poot te nemen en het contactgebied in de loop van de tijd te meten terwijl het knaagdier over de landingsbaan loopt. Elke houding wordt weergegeven door een toename van het pootoppervlak (in de remfase) en een afname van het pootoppervlak (in de voortstuwingsfase). Dit wordt uitgevoerd door de swingfase, dat is wanneer er geen pootsignaal wordt gedetecteerd. Na evaluatie van de video worden verschillende parameters gegenereerd die kunnen worden gebruikt om wild-type (WT) versus PD-model te vergelijken. Enkele voorbeelden van de parameters zijn staplengte (afstand die de poot in één stap aflegt), swingduur (duur van de tijd dat de poot niet in contact is met de landingsbaan), swingsnelheid (staplengte als functie van de swingduur) en stappatroon (diagonale stappen, zijwaartse stappen of gordelstappen).
Om het nut van FTIR aan te tonen om vroege veranderingen in looppatronen bij ratten te ontdekken, gebruikten we een genetisch rattenmodel van PD. Terwijl de meeste gevallen van PD idiopathisch zijn; de identificatie van erfelijke vormen van PD ontdekte genmutaties en varianten, zoals functieverliesmutaties in Pink1 en Parkin, twee eiwitten die betrokken zijn bij mitochondriale kwaliteitscontrole17, die kunnen worden gebruikt om diermodellen te maken18. Helaas zijn muizen resistent tegen neurodegeneratie bij verlies van deze eiwitten (enkelvoudig en gecombineerd)19,20,21. Bij ratten leidt Pink1 maar niet Parkin-deficiëntie tot nigraal DA-neuronverlies en motorische stoornissen22, maar zonder volledige penetrantie. Daarom genereerden we een gecombineerd Pink1 / Parkin double knockout (DKO) ratmodel, dat het openlijke visueel zichtbare achterste slepende fenotype weergeeft dat wordt gemeld bij mannelijke Pink1 KO-ratten22, maar nu met een hoger percentage: 100% versus 30-50% van de mannetjes tussen 4-6 maanden.
Hoewel deze methode goed werkt voor het analyseren van motorische tekorten bij muizen14, waren ftir-beeldvormingsgangsysteemspecificaties om de grootte en het gewicht van ratten te accommoderen voorheen niet-commercieel niet beschikbaar. Hier leggen we uit hoe je de RatWalker bouwt, een gemodificeerd FTIR-loopbeeldvormingssysteem gemodelleerd naar de MouseWalker14, behalve aangepast aan de grootte en het gewicht van ratten. Dit systeem maakt gebruik van een optisch effect, FTIR, om een methode te bieden om dierlijke voetafdrukken te visualiseren en vervolgens vast te leggen voor analyse. Contact van de voet van een dier met de optische golfgeleider (platform) veroorzaakt verstoring van het lichtpad, wat resulteert in een zichtbaar verstrooiingseffect, dat wordt vastgelegd met behulp van binnenlandse videografie en verwerking met behulp van open-source software. Deze studie toont de kracht van FTIR-beeldvorming bij het bestuderen van gangveranderingen in genetische ratmodellen van PD. Bijvoorbeeld, terwijl openlijk visueel zichtbare motorische veranderingen (d.w.z. achterste slepen) worden waargenomen bij mannelijke DKO-ratten op zijn vroegst na 4 maanden, kunnen we met behulp van FTIR poortafwijkingen ontdekken bij mannelijke DKO-ratten op de leeftijd van 2 maanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Loopstoornissen, waaronder verminderde armzwaai, langzamere loopsnelheid en kortere stappen, zijn een bepalend kenmerk van PD en treden vroeg op tijdens ziekteverloop 1,5. In de loop der jaren zijn verschillende methoden ontwikkeld om voetstappen voor loopanalyse in knaagdiermodellen van PD te observeren en te registreren, met handmatige technieken voor het kwantificeren van de voetvalpositie die leiden tot geautomatiseerde benaderingen die gevoeliger zijn en in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KS en HF bedanken de Michael J Fox Foundation for Parkinson’s Research voor hun steun aan hun werk aan de ziekte van Parkinson.
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson’s disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson’s disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson’s disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson’s Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. 신경과학. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson’s disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson’s disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson’s disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
