JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC’s) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Abstract

Neovascularisatie wordt meestal geïnitialiseerd vanuit een bestaande normale vasculatuur en de biomechanische micromilieu van endotheelcellen (EC’s) in de beginfase varieert dramatisch van het volgende proces van neovascularisatie. Hoewel er tal van modellen zijn om verschillende stadia van neovascularisatie te simuleren, ontbreekt een in vitro 3D-model dat het initiële proces van neovascularisatie capituleert onder de overeenkomstige stimulaties van normale vasculatuurmicromilieus nog steeds. Hier hebben we een in vitro 3D-model gereconstrueerd dat de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) nabootst. Het MIEN-model bevat een microfluïdische kiemchip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem. Een functionele, perfuseerbare microkanaal bedekt met endotheel werd gevormd en het proces van ontkiemen werd gesimuleerd in de microfluïdische kiemchip. De aanvankelijk fysiologische micromilieu van neovascularisatie werd samengevat met het microfluïdische controlesysteem, waardoor EC’s tegelijkertijd zouden worden blootgesteld aan hoge luminale schuifspanning, fysiologische transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactorverdelingen (VEGF). Het MIEN-model kan gemakkelijk worden toegepast op de studie van het neovascularisatiemechanisme en heeft een potentiële belofte als een goedkoop platform voor geneesmiddelenscreening en toxicologische toepassingen.

Introduction

Neovascularisatie vindt plaats in veel normale en pathologische processen1,2,3,4, waaronder twee belangrijke processen bij volwassenen, angiogenese en arteriogenese5. Naast de bekendste groeifactoren, zoals vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)6, zijn mechanische stimulaties, met name de door de bloedstroom veroorzaakte afschuifstress, belangrijk bij de regulatie van neovascularisatie7. Zoals we weten, variëren de omvang en vormen van schuifspanning dramatisch en dynamisch in verschillende delen van de vasculatuur, wat resulteert in belangrijke effecten op vasculaire cellen8,9,10,11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat schuifspanning verschillende aspecten van EC’s kan beïnvloeden, waaronder celfenotypische veranderingen, signaaltransductie, genexpressie en de communicatie met muurschilderingcellen13,14,15,16,17,18,19,20; dus, reguleren neovascularisatie21,22,23,24.

Daarom, om neovascularisatie beter te begrijpen, is het belangrijk om het proces in natuurlijke cellulaire micromilieu in vitrote reconstrueren. Onlangs zijn er veel modellen opgericht om microvaten te creëren en nauwkeurige controle te bieden over micromilieu25,26,27,gebruikmakend van de vooruitgang in microfabrication en microfluïdische technologie. In deze modellen kunnen microvaten worden gegenereerd door hydrogel28,29, polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische chips30,31,32 of 3D bioprinting33,34. Enkele aspecten van het micromilieu, zoals luminale schuifspanning22,23,35,36, transendotheelstroom37,38,39,40, biochemische gradiënt van angiogenefactoren 41,42, stam/rek43,44,45, en samen met andere typen cellen32,46 zijn nagebootst en gecontroleerd. Meestal werd een groot reservoir of spuitpomp gebruikt om doordrenkt medium te bieden. De transendotheelstroom in deze modellen werd gecreëerd door drukval tussen het reservoir en microbuis22,23,38,40. Het mechanische micromilieu was echter moeilijk constant op deze manier te onderhouden. De transendotheliale stroom zou toenemen en dan het fysiologische niveau overschrijden als een hoog debiet met hoge schuifspanning voor perfusie werd gebruikt. Eerdere studie toonde aan dat in de beginperiode van neovascularisatie de snelheid van de transendotheelstroom zeer laag is als gevolg van de intacte EC’s en keldermembraan, meestal minder dan 0,05 μm/s8. Ondertussen, hoewel luminale schuifspanning in vasculair systeem sterk varieert, is het relatief hoog met gemiddelde waarden van 5-20 dyn/cm2,11,47. Voorlopig is de snelheid van de transendotheelstroom in eerdere werken over het algemeen tussen 0,5-15 μm/s22,38,39,40gehouden en was de luminale schuifspanning meestal minder dan 10 dyn/cm223. Het blijft een moeilijk onderwerp om EC’s voortdurend bloot te stellen aan hoge luminale schuifspanning en fysiologisch niveau van transendotheelstroom tegelijkertijd. 

In deze studie beschrijven we een in vitro 3D-model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) na te bootsen. We ontwikkelden een microfluïdische chip en een automatisch controlesysteem, zeer efficiënt circulatiesysteem om perfusiemicrobuizen te vormen en het proces van ontkiemen48te simuleren. Met het MIEN-model wordt de micromilieu van EC’s die tijdens de eerste periode van neovascularisatie worden gestimuleerd, eerst samengevat. EC’s kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheelstroom en verschillende VEGF-distributie tegelijkertijd. We beschrijven de stappen om het MIEN-model in detail vast te stellen en de belangrijkste aandachtspunten, in de hoop een referentie te bieden aan andere onderzoekers.

Protocol

1. Waferbereiding OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor de SU-8 2075 negatieve fotoresist die tijdens dit onderzoek wordt gebruikt. Reinig de siliciumwafel 3 tot 5 keer met methanol en isopropanol op een spincoater als volgt: draai eerst 15 s bij 500 tpm en draai vervolgens 60 s bij 3.000 tpm. Breng de siliciumwafel over op een kookplaat, die voorverwarmd is tot 180 °C en bak de wafer 10 minuten. Haal de siliconen wafer van de kookplaat en koel deze af tot ka…

Representative Results

Het in vitro 3D-model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie (MIEN) na te bootsen die hier wordt gepresenteerd, bestond uit een microfluïdische kiemchip en een microfluïdisch controlesysteem. De microfluïdische kiemchip werd geoptimaliseerd uit eerdere publicaties22,23,37,40,51,52,<sup class="xr…

Discussion

Lange tijd was real-time observatie van neovascularisatie een probleem. Onlangs zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om doordrenkte vaten te creëren die bekleden met EC’s en grenzend aan de extracellulaire matrix voor het ontkiemen van22,32,40 ,46,54, maar het mechanische micromilieu is nog steeds moeilijk constant te onderhouden. Het blijft een moeilij…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 en 32071311), Nationaal belangrijk onderzoek- en ontwikkelingsprogramma van China (subsidienr. 2016YFC1101101 en 2016YFC1102202), het 111 Project (B13003) en de Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial “vessels” for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Keywords: Microfluidic ModelNeovascularizationAngiogenesisEndothelial CellsVascular Endothelial Growth FactorHydrogelShear StressCell CultureFibronectinMicrofluidic Control SystemPerfusionSprouting
check_url/kr/62003?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image