Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées
Summary
Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.
Abstract
La compréhension des mécanismes étant à la base de la différenciation et de la fonction d’adipocyte a grandement bénéficié de l’utilisation des variétés de cellule blanches immortalisées de preadipocyte. Ces lignées cellulaires cultivées, cependant, ont des limites. Ils ne capturent pas complètement le spectre fonctionnel diversifié des populations hétérogènes d’adipocytes qui sont maintenant connues pour exister dans les dépôts adipeux blancs. Pour fournir un modèle physiologiquement plus pertinent pour étudier la complexité du tissu adipeux blanc, un protocole a été développé et optimisé pour permettre l’isolement simultané des progéniteurs primaires d’adipocyte blancs et bruns des souris nouveau-nées, leur expansion rapide dans la culture, et leur différenciation in vitro en adipocytes mûrs et pleinement fonctionnels. Le principal avantage d’isoler les cellules primaires des souris nouveau-nées, plutôt que des souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent activement et sont, par conséquent, une riche source de préadipocytes proliférants. Les préadipocytes primaires isolés à l’aide de ce protocole se différencient rapidement en atteignant la confluence et deviennent pleinement matures en 4-5 jours, une fenêtre temporelle qui reflète avec précision l’apparence des coussinets gras développés chez les souris nouveau-nées. Les cultures primaires préparées à l’aide de cette stratégie peuvent être étendues et étudiées avec une reproductibilité élevée, ce qui les rend adaptées aux écrans génétiques et phénotypiques et permet l’étude des phénotypes d’adipocytes autonomes cellulaires des modèles murins génétiques. Ce protocole offre une approche simple, rapide, et peu coûteuse pour étudier la complexité du tissu adipeux in vitro.
Introduction
L’obésité résulte d’un déséquilibre chronique entre l’apport énergétique et la dépense énergétique. Au fur et à mesure que l’obésité se développe, les adipocytes blancs subissent une expansion massive de la taille des cellules qui entraîne une hypoxie dans le microenvironnement, la mort cellulaire, l’inflammation et la résistance à l’insuline1. Les adipocytes dysfonctionnels et hypertrophiés ne peuvent pas stocker correctement les lipides en excès, qui s’accumulent à la place dans d’autres tissus où ils amortissent l’action de l’insuline2,3. On prévoit que les agents qui améliorent la fonction d’adipocyte et restaurent la partition normale de lipide parmi les tissus pour être salutaires pour le traitement des conditions obésité-associées caractérisées par la résistance à l’insuline telles que le type – le diabète 2. Les écrans phénotypiques dans les adipocytes utilisant des lignées cellulaires immortalisées, telles que 3T3-L1, F442A et 10T 1/2, se sont avérés utiles pour identifier les facteurs génétiques qui régulent l’adipogenèse et pour isoler les molécules pro-adipogènes aux propriétés antidiabétiques4,5,6,7. Ces lignées cellulaires, cependant, ne reflètent pas entièrement l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans les dépôts adipeux, qui comprend des sous-types d’adipocytes blancs, bruns, beiges et autres avec des caractéristiques uniques, qui contribuent tous à l’homéostasie systémique8,9,10. De plus, les lignées cellulaires cultivées montrent souvent une réponse diminuée aux stimuli externes.
En revanche, les cultures des adipocytes primaires récapitulent plus exactement la complexité de l’adipogenesis in vivo, et les adipocytes primaires montrent des réponses fonctionnelles robustes. Les préadipocytes primaires sont typiquement isolés de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux de souris adultes11,12,13,14. Cependant, parce que les dépôts adipeux d’animaux adultes sont constitués principalement d’adipocytes pleinement matures qui ont un taux de renouvellement très lent15,16,17,cette approche donne une quantité limitée de préadipocytes avec un faible taux de prolifération. Par conséquent, l’isolement des préadipocytes de souris nouveau-nées est préférable pour obtenir de grandes quantités de cellules à croissance rapide qui peuvent être différenciées in vitro. Ici, un protocole a été décrit, inspiré par les travaux initiaux avec les adipocytes bruns primaires de Kahn et al.18 pour isoler efficacement les préadipocytes blancs et bruns qui peuvent être élargis et différenciés in vitro en adipocytes primaires pleinement fonctionnels(figure 1A). L’avantage d’isoler les cellules primaires du nouveau-né, par opposition aux souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent rapidement et sont donc une riche source de préadipocytes qui prolifèrent activement17. Les cellules isolées à l’aide de ce protocole ont une capacité proliférative élevée, permettant une mise à l’échelle rapide des cultures. De plus, les préadipocytes des nouveau-nés présentent un potentiel de différenciation plus élevé que les progéniteurs adultes, ce qui réduit la variabilité d’un puits à l’autre de l’étendue de la différenciation et augmente ainsi la reproductibilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tissu adipeux est essentiel pour la sensibilité systémique à l’insuline et l’homéostasie du glucose20. Le dysfonctionnement lié à l’obésité d’adipocyte est étroitement associé à l’apparition du diabète de type 2. Par conséquent, une plus grande compréhension de la biologie et de la physiologie de base du tissu adipeux peut permettre la conception de nouveaux traitements pour des désordres métaboliques. En complément de l’analyse fonctionnelle et transcriptionnelle d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à Cristina Godio du Centro Nacional de Biotecnología de Madrid, en Espagne, à Mari Gantner de l’Institut de recherche Scripps, La Jolla, et à Anastasia Kralli de l’Université Johns Hopkins de Baltimore pour leur aide à optimiser ce protocole sur la base des travaux initiaux de Kahn et al.18. Ce travail a été financé par les subventions DK114785 et DK121196 des NIH à E.S.
Materials
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
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