Method Article

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

DOI:

10.3791/62020

⸱

April 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 2Institute of Functional Genomics, M.V. Lomonosov Moscow State University, 3National Research Centre "Kurchatov Institute"

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

Abstract

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미토콘드리아는 호기성 호흡이 가능한 진핵세포의 필수 세포입니다. 그(것)들은 원형 게놈 및 유전자 발현 장치를 포함합니다. 제빵사의 효모의 미토콘드리아 게놈은 8가지 단백질을 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p의 서브유닛. 여기서 설명된 방법의 목적은 이러한 단백질을 35S메티오닌으로 구체적으로 라벨링하고, 전기포고에 의해 분리하고 신호를 화면에 이산밴드로 시각화하는 것이다. 절차는 몇 가지 단계를 포함한다. 첫째, 효모 세포는 후기 로와산성장 단계에 도달할 때까지 갈라토스 함유 배지에서 배양된다. 다음으로, 사이클로헤시미드 치료는 세포질 번역을 차단하고 미토콘드리아 번역 제품에만 35S 메티오닌을 통합할 수 있습니다. 그런 다음, 모든 단백질은 효모 세포에서 추출되고 폴리 아크릴라미드 젤 전기 포광에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 젤은 저장 인광판으로 건조되고 배양됩니다. 화면은 밴드를 드러내는 인산화기에서 스캔됩니다. 이 방법은 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 연구하는 데 유용한 야생형대 돌연변이 효모 균주의 미토콘드리아내 단일 폴리펩타이드의 생합성 율을 비교하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그러나 적절한 결론을 내리기 위해서는 여러 가지 제어 및 추가 실험이 필요합니다.

Introduction

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미토콘드리아는 진핵 세포의 대사에 깊이 관여하는 세포기관입니다. 그들의 전자 전송 사슬은 여러 생화학 경로에 사용되는 주요 에너지 통화 인 ATP로 세포를 공급합니다. 게다가, 그들은 석 면에 관여, 지방산과 헴 합성, 그리고 다른 프로세스. 미토콘드리아의 기능 장애는 인간 질환 1의 잘 알려진소스이다. 그것은 세포기관2의구조 또는 조절 성분을 코딩하는 핵 또는 미토콘드리아 유전자에 있는 돌연변이에서 유래할 수 있습니다. 베이커의 효모 사카로미세스 세레비시아는 여러 가지 이유로 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 우수한 모델 유기체입니다. 첫째, 그들의 게놈은 완전히 시퀀스3,잘 음부, 데이터의 큰 합계는 이 유기체로 실행된 조사의 긴 역사 덕분에 문학에서 이미 유효합니다. 둘째, 핵 게놈을 가진 조작은 그들의 빠른 성장 속도와 고도로 효율적인 상동성 재조합 시스템 때문에 상대적으로 빠르고 쉽습니다. 셋째, 제빵사의 효모 S. cerevisiae는 미토콘드리아 게놈으로 조작이 개발되는 몇 안되는 유기체 중 하나입니다. 마지막으로, 제빵사의 효모는 발효 탄소 공급원을 함유하는 미디어에서 성장할 수 있기 때문에 호흡기 결함이 있는 돌연변....

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Protocol

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1. 효모 문화 준비

  1. 냉동 재고 배양에서 적절한 매체로 신선한 접시에 효모를 줄입니다. 24-48h에 대한 30 °C에서 배양 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
    참고: 온도에 민감한 돌연변이가 허용 온도에서 자랄 수 있도록 합니다.
  2. YPGal 배지 2mL(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 갈모 추출물 2%)에서 효모 배양을 접종하여 15mL 튜브의 신선한 줄무늬에서 30°C에서 200rpm에서 밤새 교반하는 배양합니다.
  3. 600nm(OD600)의파장에서 배양의 광학 밀도를 측정한다.
  4. 멸균 튜브에 0.2 흡광도 단위에 대응하는 부피를 취하고, 실온에서 30 초 동안 9,000 x g의 펠릿 효모 세포를 복용하고 상복부을 폐기하십시오.
  5. 5 s에 대 한 소용돌이하 여 멸 균 수의 0.5 mL로 셀을 세척. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 초 동안 9,000 x g에서 슈퍼 나탄을 폐기합니다. 신선한 YPGal 배지의 2 mL에 세포를 희석.
  6. OD 600이 1.5-1.9 값에 도달할 때까지200 rpm 및 30°C에서 교반하는 배양.
    참고: 효모 성장률은 다양하므로 기다릴 준비를 하십시오. 이른 아침에 1.3-1.6....

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Results

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전술한 프로토콜에 따라, 우리는 두 가지 S. 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당: 야생 형(WT)및 AIM23 유전자의 돌연변이 베어링 삭제(AIM23Δ),인코딩 미토콘드리아 번역 개시 인자 3(표 1)8. 미토콘드리아 번역 제품은 SDS-PAAG9에서 방사성 라벨을 부착하고 분리시켰다. 샘플은 포화 전에 2.5 분마다 수집하여 시간 과정(그림 1A)을구축했습니다. 젤은 5일박람회(도 1A)를거쳐 염색, 건조, 스크리닝하였다.

성공적인 실험의 경우, 그림은 표준 패턴4에따라 할당된 8개의 밴드를 보여줍니다. 그러나, 개별 밴드의 강도는 변형 및 실험 조건에 따라 매우 가변적일 수 있다.......

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Discussion

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유전자 발현의 조사는 현대 생명 과학에 있는 중앙 부분을 차지합니다. 이 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 제공하는 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기서, 우리는 베이커의 효모 S. cerevisiae 미토콘드리아에서 단백질 생합성에 접근하는 것을 허용하는 방법을 설명했습니다. 그것은 일반적으로 연구된 돌연변이의 결과에 접근하기 위하여 돌연변이 효모 긴장대 미토콘드리아에 있는 mRNAs의 번역 효율성을 비교하기 위하여 이용됩니다. 이것은 미토콘드리아8,11,12,13에영향을 미칠 것을 건의한 돌연변이를 가진 효모 세포의 미토콘드리아 기능을 연구할 때 연구원이 수행하는 기본적인 실험의 한개이다. 그것은 수시로 산소 소비 비율 및 미토콘드리아 막 잠재력의 측정과 결합됩니다. 그러나, 제공하는.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 기본 연구를위한 러시아 재단에 의해 투자되었다, 부여 번호 18-29-07002. P.K.는 러시아 연방 과학기술고등교육부의 국가 배정에 의해 지원되었으며, AAAA-A16-11602160073-5를 지원받았다. M.V.P.는 러시아 연방 과학 고등 교육부의 지원을 받았으며, 교부번호 075-15-2019-1659(게놈 연구 의 쿠르차토프 센터 프로그램)를 지원받았습니다. 이 작업은 부분적으로 모스크바 주립 대학 개발 프로그램의 프레임에서 구입 한 장비에 수행되었다. I.C., S.L., M.V..B.는 모스크바 주립 대학 교부금 "노아의 방주를 선도하는"에 의해 추가로 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
아크릴아미드시그마-알드리치A9099
과황산암모늄시그마-알드리치A3678
세균학 한천시그마-알드리치A5306 
바이오웨이브 세포 밀도계 CO8000BIOCHROM US BE80-3000-45
브랜드 표준 일회용 큐벳시그마-알드리치Z330361
클로로포름시그마-알드리치288306 
시클로헥시미드시그마-알드리치C1988 
D-(+)-갈락토스시그마-알드리치G5388 
D-(+)-포도시그마-알드리치G7021 
디지털 블록 히터Thermo Scientific88870001
EasyTag L-[35S]-메티오닌, 500µ Ci (18.5MBq), 안정화된 수용액Perkin ElmerNEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425Thermo Scientific13-864-457
GE 저장 인광 스크린Sigma-AldrichGE29-0171-33
L-메티오닌Sigma-AldrichM9625 
메탄올시그마-알드리치34860 
N,N,N′,N′-TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281
N,N′-메틸렌비스아크릴아미드Sigma-AldrichM7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker IncubatorNew Brunswick Scientific
고기에서 추출한 펩톤, 세균학Millipore91249 
페닐 메탄 설포닐 플루오라이드시그마-알드리치P7626 
Pierce 660nm 단백질 분석 키트Thermo Scientific22662
PowerPac 기본 전원 공급 장치Bio-Rad1645050
Protean II xi cellBio-Rad1651802
Streptomyces alboniger의 Puromycin dihydrochlorideSigma-AldrichP8833
수산화나트륨Sigma-Aldrich221465
Storm 865 인광 이미저GE 헬스케어
Trizma 베이스Sigma-Aldrich93352 
진공 가열 젤 건조기클리버 사이버, 과학CSL-GDVH
효모 추출물시그마-알드리치Y1625 
당 적인

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  2. Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
  3. G....

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