Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Abstract

Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit ³⁵S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt ³⁵S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.

Introduction

Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit¹. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren². Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung der mitochondrialen Genexpression. Erstens ist ihr Genom vollständig sequenziert³, gut annotiert, und eine große Summe von Daten ist bereits in der Literatur dank der langen Geschichte der Untersuchungen mit diesem Organismus durchgeführt. Zweitens sind die Manipulationen mit ihrem Kerngenom aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und ihres hocheffizienten homologen Rekombinationssystems relativ schnell und einfach. Drittens ist die Bäckerhefe S. cerevisiae einer der wenigen Organismen, für die die Manipulationen mit mitochondrialen Genomen entwickelt werden. Schließlich ist Bäckerhefe ein aerobe-anaerobe fakultativer Organismus, der die Isolierung und Untersuchung von atemmedizinischen defekten Mutanten ermöglicht, da sie in Medien wachsen können, die fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten.

Wir beschreiben die Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Genexpression der Bäckerhefe S. cerevisiae auf der Translationsebene⁴. Sein Hauptprinzip ergibt sich aus mehreren Beobachtungen. Erstens kodiert das Hefemitochondrialgenom nur acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-c-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondriales ribosomales Protein Var1p⁵. Diese Zahl ist klein, und alle von ihnen können durch Elektrophorese auf einem einzigen Gel unter den entsprechenden Bedingungen getrennt werden. Zweitens gehören mitochondriale Ribosomen eher zur prokaryotischen Klasse als zu eukaryotischen⁶, und daher ist die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bei Hefezytoplasma- und Mitochondrienribosomen unterschiedlich. Es ermöglicht die Hemmung der zytoplasmatischen Translation mit Cycloheximid, die Bedingungen, wenn die markierte Aminosäure⁽³⁵S-Methionin) nur in mitochondrialen Übersetzungsprodukten enthalten ist. Als Ergebnis liefert das Experiment Informationen über die Rate der Aminosäure-Inkorporation in mitochondrialen Proteinen synthetisiert de novo, was die Gesamteffizienz der mitochondrialen Übersetzung für jedes der acht Produkte widerspiegelt

Protocol

1. HefekulturVorbereitung Streifen Hefe aus den gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit dem entsprechenden Medium. Legen Sie die Platten in einen Kultur-Inkubator bei 30 °C für 24-48 h.HINWEIS: Lassen Sie die temperaturempfindlichen Mutanten bei der freizügigen Temperatur wachsen. Hefekulturen in 2 ml YPGal-Medium (2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Galaktose) aus dem frischen Streifen in 15 ml-Röhrchen impfen und über Nacht bei 200 U/min bei 30 °C aufregen. Messen Sie die opt…

Representative Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei S. cerevisiae Stämmen zugewiesen: den wilden Typ (WT) und eine mutierte Lagerlöschung des AIM23-Gens (AIM23 ),die mitochondrialen Translationinitiationsfaktor 3 (Tabelle 1)8kodieren. Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden in SDS-PAAG9 radioaktiv gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle 2,5 min vor der Sättigung gesammelt, um einen Zei…

Discussion

Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutati…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625