Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Baker’s gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Abstract

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryotische cellen die in staat zijn tot aërobe ademhaling. Ze bevatten cirkelvormige genoom- en genexpressieapparatuur. Een mitochondriaal genoom van bakkersgist codeert voor acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p. Het doel van de hier beschreven methode is om deze eiwitten specifiek te labelen met ³⁵S methionine, ze te scheiden door elektroforese en de signalen te visualiseren als discrete banden op het scherm. De procedure omvat verschillende stappen. Ten eerste worden gistcellen gekweekt in een galactosebevattend medium totdat ze de late logaritmische groeifase bereiken. Vervolgens blokkeert cycloheximidebehandeling cytoplasmatische vertaling en staat ³⁵S methionine-integratie alleen toe in mitochondriale vertaalproducten. Vervolgens worden alle eiwitten geëxtraheerd uit gistcellen en gescheiden door polyacrylamide gelelektroforese. Ten slotte wordt de gel gedroogd en geïncubeerd met het opslagfosforscherm. Het scherm wordt gescand op een fosforimager die de banden onthult. De methode kan worden toegepast om de biosynthesesnelheid van een enkel polypeptide in de mitochondriën van een mutante giststam te vergelijken met het wilde type, wat nuttig is voor het bestuderen van mitochondriale genexpressiedefecten. Dit protocol geeft waardevolle informatie over de vertaalsnelheid van alle gist mitochondriale mRNA’s. Het vereist echter verschillende controles en aanvullende experimenten om goede conclusies te trekken.

Introduction

Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte¹. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen². Baker’s gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom volledig^{gesequentieerd 3}, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.

We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 te^bestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p⁵. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch⁶, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (³⁵S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt

Protocol

1. Gistkweekbereiding Streepgist uit de bevroren stamculturen op verse borden met het juiste medium. Doe de platen 24-48 uur in een kweekincubator bij 30 °C.OPMERKING: Laat de temperatuurgevoelige mutanten groeien bij de toegestane temperatuur. Ent gistculturen in 2 ml YPGal medium (2% pepton, 1% gistextract, 2% galactose) uit de verse streep in 15 ml buizen en incubeer ze ‘s nachts roeren bij 200 tpm bij 30 °C. Meet de optische dichtheid van de cultuur bij een golflengte van 600 nm (O…

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we mitochondriale vertaalproducten toegewezen van twee S. cerevisiae stammen: het wilde type (WT) en een mutante dragende deletie van het AIM23-gen (AIM23Δ), dat codeert voor mitochondriale vertalingsinitiatiefactor 3 (tabel 1)8. Mitochondriale vertaalproducten werden radioactief geëtiketteerd en gescheiden in SDS-PAAG9. De monsters werden elke 2,5 minuut vóór verzadiging verzameld om een tijd…

Discussion

Onderzoeken naar genexpressie spelen een centrale rol in de moderne levenswetenschappen. Er zijn tal van methoden ontwikkeld die inzicht geven in dit complexe proces. Hier beschreven we de methode die toegang geeft tot eiwitbiosynthese in bakkersgist S. cerevisiae mitochondriën. Het wordt meestal toegepast om vertaalefficiënties van de mRNA’s in mitochondriën van mutante giststam versus wild type te vergelijken om toegang te krijgen tot de gevolgen van de bestudeerde mutatie. Dit is een van de basisexperiment…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625