베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화
Summary
베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.
Abstract
미토콘드리아는 호기성 호흡이 가능한 진핵세포의 필수 세포입니다. 그(것)들은 원형 게놈 및 유전자 발현 장치를 포함합니다. 제빵사의 효모의 미토콘드리아 게놈은 8가지 단백질을 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p의 서브유닛. 여기서 설명된 방법의 목적은 이러한 단백질을 35S메티오닌으로 구체적으로 라벨링하고, 전기포고에 의해 분리하고 신호를 화면에 이산밴드로 시각화하는 것이다. 절차는 몇 가지 단계를 포함한다. 첫째, 효모 세포는 후기 로와산성장 단계에 도달할 때까지 갈라토스 함유 배지에서 배양된다. 다음으로, 사이클로헤시미드 치료는 세포질 번역을 차단하고 미토콘드리아 번역 제품에만 35S 메티오닌을 통합할 수 있습니다. 그런 다음, 모든 단백질은 효모 세포에서 추출되고 폴리 아크릴라미드 젤 전기 포광에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 젤은 저장 인광판으로 건조되고 배양됩니다. 화면은 밴드를 드러내는 인산화기에서 스캔됩니다. 이 방법은 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 연구하는 데 유용한 야생형대 돌연변이 효모 균주의 미토콘드리아내 단일 폴리펩타이드의 생합성 율을 비교하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그러나 적절한 결론을 내리기 위해서는 여러 가지 제어 및 추가 실험이 필요합니다.
Introduction
미토콘드리아는 진핵 세포의 대사에 깊이 관여하는 세포기관입니다. 그들의 전자 전송 사슬은 여러 생화학 경로에 사용되는 주요 에너지 통화 인 ATP로 세포를 공급합니다. 게다가, 그들은 석 면에 관여, 지방산과 헴 합성, 그리고 다른 프로세스. 미토콘드리아의 기능 장애는 인간 질환 1의 잘 알려진소스이다. 그것은 세포기관2의구조 또는 조절 성분을 코딩하는 핵 또는 미토콘드리아 유전자에 있는 돌연변이에서 유래할 수 있습니다. 베이커의 효모 사카로미세스 세레비시아는 여러 가지 이유로 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 우수한 모델 유기체입니다. 첫째, 그들의 게놈은 완전히 시퀀스3,잘 음부, 데이터의 큰 합계는 이 유기체로 실행된 조사의 긴 역사 덕분에 문학에서 이미 유효합니다. 둘째, 핵 게놈을 가진 조작은 그들의 빠른 성장 속도와 고도로 효율적인 상동성 재조합 시스템 때문에 상대적으로 빠르고 쉽습니다. 셋째, 제빵사의 효모 S. cerevisiae는 미토콘드리아 게놈으로 조작이 개발되는 몇 안되는 유기체 중 하나입니다. 마지막으로, 제빵사의 효모는 발효 탄소 공급원을 함유하는 미디어에서 성장할 수 있기 때문에 호흡기 결함이 있는 돌연변이를 격리하고 연구할 수 있는 에어로브-혐기성 자극 유기체입니다.
우리는 번역 수준4에서제빵사 효모 S. cerevisiae의 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 방법을 설명합니다. 그것의 주요 원칙은 여러 관찰에서 온다. 첫째, 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 단백질만 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p5의서브유닛. 이 숫자는 작고, 그들 모두는 적절한 조건에서 단일 젤에 전기 전광에 의해 분리 될 수있다. 둘째, 미토콘드리아 리보솜은 진핵6이아닌 원핵계 클래스에 속하며, 따라서 항생제에 대한 민감성은 효모 세포질 및 미토콘드리아 리보좀에 대해 다릅니다. 그것은 세포혈증 번역의 억제를 허용, 라벨 아미노산(35S-메티오닌)가 미토콘드리아 번역 제품에만 통합 될 때 조건을 제공. 그 결과, 이 실험은 미토콘드리아 단백질합성 드 노보에 아미노산 의 혼입 속도에 대한 정보를 제공하여 8개 제품에 대한 미토콘드리아 번역의 전반적인 효율을 반영합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 발현의 조사는 현대 생명 과학에 있는 중앙 부분을 차지합니다. 이 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 제공하는 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기서, 우리는 베이커의 효모 S. cerevisiae 미토콘드리아에서 단백질 생합성에 접근하는 것을 허용하는 방법을 설명했습니다. 그것은 일반적으로 연구된 돌연변이의 결과에 접근하기 위하여 돌연변이 효모 긴장대 미토콘드리아에 있는 mRNAs?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 기본 연구를위한 러시아 재단에 의해 투자되었다, 부여 번호 18-29-07002. P.K.는 러시아 연방 과학기술고등교육부의 국가 배정에 의해 지원되었으며, AAAA-A16-11602160073-5를 지원받았다. M.V.P.는 러시아 연방 과학 고등 교육부의 지원을 받았으며, 교부번호 075-15-2019-1659(게놈 연구 의 쿠르차토프 센터 프로그램)를 지원받았습니다. 이 작업은 부분적으로 모스크바 주립 대학 개발 프로그램의 프레임에서 구입 한 장비에 수행되었다. I.C., S.L., M.V..B.는 모스크바 주립 대학 교부금 “노아의 방주를 선도하는”에 의해 추가로 지원되었다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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