O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.
Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina 35S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina 35S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.
Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana1. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas2. O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expressão genética mitocondrial devido a várias razões. Primeiro, seu genoma é completamente sequenciado3, bem anotado, e uma grande soma de dados já está disponível na literatura graças à longa história de investigações realizadas com esse organismo. Em segundo lugar, as manipulações com seu genoma nuclear são relativamente rápidas e fáceis devido à sua taxa de crescimento rápido e sistema de recombinação homólogo altamente eficiente. Em terceiro lugar, a levedura de padeiro S. cerevisiae é um dos poucos organismos para os quais as manipulações com genomas mitocondriais são desenvolvidas. Finalmente, a levedura do padeiro é um organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite o isolamento e o estudo de mutantes com defeito respiratório, uma vez que eles podem crescer em mídia contendo fontes de carbono fermentáveis.
Descrevemos o método para estudar a expressão genética mitocondrial da levedura de padeiro S. cerevisiae no nível translacional4. Seu princípio principal vem de várias observações. Primeiro, o genoma mitocondrial da levedura codifica apenas oito proteínas: três subunidades do citocromo c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb), e proteína ribossômica mitocondrial Var1p5. Este número é pequeno, e todos eles podem ser separados por eletroforese em um único gel nas condições apropriadas. Em segundo lugar, ribossomos mitocondriais pertencem à classe procariótica em vez de eucariótico6, e, portanto, a sensibilidade aos antibióticos é diferente para ribossmos citoplasmáticos e mitocondriais de levedura. Permite a inibição da tradução citoplasmática com cicloheximida, proporcionando as condições quando o aminoácido rotulado (35S-methionina) é incorporado apenas em produtos de tradução mitocondrial. Como resultado, o experimento fornece informações sobre a taxa de incorporação de aminoácidos em proteínas mitocondriais sintetizadas de novo, refletindo a eficiência global da tradução mitocondrial para cada um dos oito produtos
Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos b?…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Russa de Pesquisa Básica, bolsa número 18-29-07002. P.K. foi apoiado pela Atribuição Estadual do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, número de subvenção AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, bolsa número 075-15-2019-1659 (Programa do Centro Kurchatov de Pesquisa de Genoma). O trabalho foi parcialmente feito no equipamento adquirido no quadro do Programa de Desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou. I.C., S.L., e M.V.B. foram apoiados adicionalmente pela bolsa da Universidade Estadual de Moscou “Leading Scientific School Noah’s Ark”.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |