Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердцах эмбрионов рыбок данио
Summary
Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.
Abstract
Воздействие тонкодисперсных частиц(ТЧ 2,5)может привести к токсичности для развития сердца, но основные молекулярные механизмы все еще неясны. 8-гидрокси-2’дезоксигеназа (8-OHdG) является маркером окислительного повреждения ДНК, а γH2AX является чувствительным маркером для разрывов двухцепочечных ДНК. В этом исследовании мы стремились обнаружить изменения PM2,5-индуцированных8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио с использованием иммунофлуоресцентного анализа. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемыми органическими веществами (EOM) изPM 2,5 при 5 мкг/мл в присутствии или отсутствии антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина (NAC, 0,25 мкМ) через 2 ч после оплодотворения (hpf). DMSO использовался в качестве управления транспортным средством. При 72 л.с. сердца были рассечены от эмбрионов с помощью шприцевой иглы и зафиксированы и пронизывались. После блокировки образцы были исследованы первичными антителами против 8-OHdG и γH2AX. Затем образцы промывали и инкубировали с вторичными антителами. Полученные изображения наблюдались под флуоресцентной микроскопией и количественно оценивались с помощью ImageJ. Результаты показывают, что EOM от PM2.5 значительно усиливает сигналы 8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, NAC, действуя как поглотитель активных форм кислорода (ROS), частично противодействовал повреждению ДНК, вызванному EOM. Здесь мы представляем протокол иммунофлуоресценции для исследования роли повреждения ДНК в пороках сердца, вызванныхPM 2,5,который может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в окружающей среде, вызванных химическими веществами, в сердцах эмбрионов рыбок данио.
Introduction
Загрязнение воздуха в настоящее время является серьезной экологической проблемой, стоящей перед миром. Окружающие тонкодисперсные твердые частицы(ТЧ 2,5),которые являются одним из важнейших показателей качества воздуха, могут переносить большое количество вредных веществ и поступать в кровеносную систему, нанося серьезный вред здоровьючеловека1. Эпидемиологические исследования показали, что воздействиеТЧ 2,5 может привести к повышенному риску врожденных пороков сердца (ИБС)2,3. Данные экспериментов на животных также показали, чтоPM 2,5 может вызывать аномальное сердечное развитие у эмбрионов рыбок данио и потомства мышей, но молекулярные механизмы сердечной токсичности развития PM2,5 все еще в значительной степени неизвестны4,5,6.
Повреждение ДНК может вызвать остановку клеточного цикла и вызвать апоптоз, который может значительно разрушить потенциал клеток-прародителей и, следовательно, ухудшить развитие сердца7). Хорошо задокументировано, что загрязнители окружающей среды, включаяТЧ 2,5,могут атаковать ДНК через механизмы окислительного стресса8,9. Как у человека, так и у рыбок данио сердечное развитие чувствительно к окислительнойнагрузке10,11,12. 8-OHdG является маркером окислительного повреждения ДНК, а сигнал γH2AX является маркером двухцепочечных разрывов ДНК. N-ацетил-L-цистеин (NAC), синтетический предшественник внутриклеточного цистеина и глутатиона, широко используется в качестве антиоксидантного соединения. В этом исследовании мы используем NAC для изучения роли окислительного стресса вPM 2.5– индуцированном повреждении ДНК13.
Рыбки данио как модельные позвоночные широко использовались для изучения сердечного развития и сердечно-сосудистых заболеваний человека, поскольку механизмы развития сердца высоко сохраняются среди позвоночных14,15. Преимущества использования рыбок данио в качестве модели включают их небольшой размер, сильную репродуктивную способность и низкую стоимость кормления. Особый интерес для этих исследований представляет то, что эмбрионы рыбок данио не зависят от кровеносной системы в период раннего развития и могут пережить тяжелую пороки сердца14. Более того, их прозрачность позволяет непосредственно наблюдать под микроскопом все тело. Таким образом, эмбрионы рыбок данио предоставляют выдающуюся возможность для оценки молекулярных механизмов, участвующих в индукции токсичности сердечного развития в результате воздействия различных химических веществ окружающей среды5,16,17. Ранее мы сообщали, что окислительный стресс, вызванныйPM 2,5,приводит к повреждению ДНК и апоптозу, что приводит к порокам сердца у рыбок данио18. В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол для изучения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердце эмбрионов рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя рыбки данио является отличной моделью позвоночных для изучения токсичности химических веществ окружающей среды для развития сердца, из-за небольшого размера сердца эмбриона трудно получить достаточное количество белка для анализа вестерн-блэт. Поэтому мы представляем чувствит?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом наук о природе Китая (номер гранта: 81870239, 81741005, 81972999) и Приоритетным академическим программным развитием высших учебных заведений Цзянсу.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
