斑马鱼卵巢卵巢中卵泡细胞和卵母细胞的分离
Summary
在这里，我们提出了一个简单的方法来分离斑马鱼卵泡中的卵泡细胞和卵母细胞，这将促进斑马鱼卵巢发育的调查。
Abstract
斑马鱼已成为研究脊椎动物卵巢发育的理想模型。卵泡是卵巢的基本单位，由卵母细胞和周围的卵泡细胞组成。为了各种研究目的，如卵泡细胞的初级培养、基因表达分析、卵母细胞成熟和体外受精等，将卵泡细胞和卵母细胞分开至关重要。传统方法使用钳子将两个隔间分开，这既费力又费时，对卵母细胞有很高的损伤。在这里，我们建立了一个简单的方法，使用拉玻璃毛细丝分离两个隔间。在立体显微镜下，卵母细胞和卵泡细胞可以通过在拉细玻璃毛细管中管道轻松分离（直径取决于毛囊直径）。与传统方法相比，这种新方法在分离卵母细胞和卵泡细胞方面效率高，对卵母细胞的损伤较低。更重要的是，这种方法可以应用于早期卵泡，包括在存活前阶段。因此，这种简单的方法可以用来分离斑马鱼的卵泡细胞和卵母细胞。
Introduction
斑马鱼是脊椎动物发育和生理学研究的主要模型生物体。斑马鱼可以作为研究卵巢发育1、2、3分子机制的良好模型。在从鱼类到哺乳动物的进化过程中，卵巢发育的许多特征都受到很大的保护。与其他脊椎动物类似，斑马鱼成人有异步卵巢，包含所有发育阶段4的卵巢卵泡。卵泡是卵巢的基本生殖元素。卵泡由卵母细胞组成，由一层或几层称为卵泡细胞的体细胞包围。卵泡的发育取决于卵母细胞和卵泡细胞之间的双向交流。为了不同的研究目的，如卵泡细胞原培养、基因表达分析、卵母细胞成熟和体外受精，将卵泡细胞和卵母细胞分离至关重要。
传统的分离方法包括机械分离的钳子和酶消化6，7，8，9，10。然而，用钳子进行机械分离既费时又费力。在分离过程中，它还会对卵母细胞造成高损伤。虽然酶消化方法操作简单，需要较短的时间，但应验证治疗时间和酶浓度，分离卵母细胞的完整性和存活率不理想。因此，我们建立了一个简单的方法，使用拉玻璃毛细管在不同的发育阶段分离两个隔间。
Protocol
鱼类实验的所有程序均符合西北师范大学动物实验伦理委员会的规定。 1. 准备 动物 使用体长为4-6厘米的成年雌性斑马鱼。注：我们使用当地市场的斑马鱼。 将斑马鱼保持在循环水系统中，在大约 28 °C 时具有 14 h 光和 10 h 黑暗循环。 每天用新孵化的盐水虾喂鱼两次。 拉玻璃毛细 使用15厘米的玻璃毛细，并将其头部放?…
Representative Results
这种方法可用于分离斑马鱼卵巢卵泡发育不同阶段的卵泡细胞和卵母细胞。 图1 显示斑马鱼卵母细胞和卵泡细胞与卵巢卵泡使用毛细管分离（图1）。为了调查卵泡细胞是否从完整的卵泡中分离出来，从光伏阶段到FG阶段的卵泡不同阶段的完整卵泡和分离的卵母细胞在37°C处染上DAPI（50微克/毫升），持续30分钟。卵泡细胞的细胞核可以通过DAPI染色。DAPI的…
Discussion
我们在这里描述了一种从斑马鱼卵泡中简单而快速地分离卵泡细胞和卵母细胞的新方法。这种方法比传统方法有几个优点。其中最主要的是大大提高了分离的便利性，效率高，效率高，因为只需要一个单一的和外部的操作。这一点增加了不擅长微观解剖学的研究人员的适用性。根据我们的经验，一个人可以成功地分离卵泡细胞和卵母细胞从完全生长的阶段卵泡在5-10s使用玻璃毛细管。但是，使用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究工作由中国国家自然科学基金委员会（32060170、31601205和31560334）支持，访问学者项目由中国奖学金委员会和国家淡水生态与生物技术重点实验室[2020FB05]资助。
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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Cite This Article
Wang, W., Kang, T., Bai, L., Hu, W., Obata, Y., Li, J. Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62027, doi:10.3791/62027 (2021).