Adskillelse af follikulære celler og oocytter i æggestokkene Follikler af zebrafisk
Summary
Her præsenterer vi en enkel metode til adskillelse af follikulære celler og oocytter i zebrafisk æggestokkene follikler, som vil lette undersøgelser af æggestokkene udvikling i zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk er blevet en ideel model til at studere æggestokkenes udvikling af hvirveldyr. Follikel er den grundlæggende enhed af æggestokken, som består af oocytter og omgivende follikulære celler. Det er vigtigt at adskille både follikulære celler og oocytter til forskellige forskningsformål, såsom til primærkultur af follikulære celler, analyse af genekspression, oocytmodning og in vitro-befrugtning osv. Den konventionelle metode bruger pincet til at adskille begge rum, hvilket er besværligt, tidskrævende og har stor skade på oocyten. Her har vi etableret en enkel metode til at adskille begge rum ved hjælp af en trukket glas kapillær. Under et stereomikroskop kan oocytter og follikulære celler let adskilles ved pipetter i en trukket fin glaskapillær (diameteren afhænger af follikeldiameteren). Sammenlignet med den konventionelle metode har denne nye metode høj effektivitet i adskillelsen af både oocytter og follikulære celler og har lav skade på oocytterne. Endnu vigtigere er det, at denne metode kan anvendes på tidlige follikler, herunder på præ-vitellogenesis-fasen. Således kan denne enkle metode bruges til at adskille follikulære celler og oocytter af zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk er en vigtig modelorganisme til undersøgelse af hvirveldyrudvikling og fysiologi. Zebrafisken kan tjene som en god model til at studere de molekylære mekanismer i æggestokkenes udvikling1,2,3. Mange funktioner i æggestokkene udvikling er meget bevaret under udviklingen fra fisk til pattedyr1,2. Svarende til de andre hvirveldyr, zebrafisk voksne har asynkrone æggestokke, der indeholder æggestokkene follikler af alle udviklingsstadier4. Follikel er det grundlæggende reproduktive element i æggestokken. Follikel består af oocyt, der er omgivet af et eller flere lag af somatiske celler kaldet follikulære celler. Udviklingen af follikler afhænger af den tovejskommunikation mellem oocytter og follikulære celler5. Det er vigtigt at adskille follikulære celler og oocytter fra æggestokkene follikler til forskellige forskningsformål såsom follikulær celle primære kultur, genekspression analyse, oocyt modning, og in vitro befrugtning.
Traditionelle adskillelsesmetoder omfatter mekanisk adskillelse ved tang og enzymatisk fordøjelse6,7,8,9,10. Men den mekaniske adskillelse med pincet er tidskrævende og besværlig. Det vil også forårsage den store skade på oocyten under adskillelsen. Selvom enzymfordøjelsesmetoden er enkel at betjene og kræver kort tid, skal behandlingstiden og enzymkoncentrationen valideres, og integriteten og overlevelsesraten for de isolerede oocytter er ikke ideel. Derfor har vi etableret en enkel metode til at adskille begge rum i forskellige udviklingsstadier ved hjælp af trukket glas kapillær rør.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en ny metode til enkel og hurtig adskillelse af follikulære celler og oocytter fra zebrafisk æggestokkene follikler. Denne metode har flere fordele i forhold til den konventionelle metode. Primær blandt disse er den stærkt øgede lethed af adskillelse med høj effektivitet og effektivitet, da kun en enkelt og ekstern manipulation er påkrævet. Dette punkt øger anvendeligheden for forskere, der ikke er gode til mikroskopisk anatomi. Ifølge vores erfaring kan man med succes adskille follikulære cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsarbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 og 31560334], gæsteforskerprojekt støttet af China Scholarship Council og fonden for State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. 발생학. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
