जेब्राफिश के ओवेरियन रोम में कूप कोशिकाओं और ओसाइट्स का पृथक्करण
Summary
यहां, हम जेब्राफिश ओवेरियन रोम में कूप कोशिकाओं और ओसाइट्स को अलग करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं, जो जेब्राफिश में अंडाशय के विकास की जांच की सुविधा प्रदान करेगा।
Abstract
जेब्राफिश कशेरुकी के अंडाशय के विकास का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल बन गया है। कूप अंडाशय की मूल इकाई है, जिसमें ओसाइट्स और आसपास के कूप कोशिकाएं होती हैं। विभिन्न शोध उद्देश्यों के लिए कूप कोशिकाओं और ओसाइट्स दोनों को अलग करना महत्वपूर्ण है जैसे कि कूप कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति, जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण, ओसाइट परिपक्वता और इन विट्रो निषेचन आदि। पारंपरिक विधि दोनों डिब्बों को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करती है, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली है और ओसाइट को उच्च क्षति होती है। यहां, हमने खींचे गए ग्लास केशिका का उपयोग करके दोनों डिब्बों को अलग करने के लिए एक सरल विधि स्थापित की है। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, ओसाइट्स और कूप कोशिकाओं को आसानी से एक खींचे गए ठीक ग्लास केशिका (व्यास कूप व्यास पर निर्भर करता है) में पाइपिंग द्वारा अलग किया जा सकता है। पारंपरिक विधि के साथ तुलना में, इस नई विधि दोनों oocytes और कूप कोशिकाओं को अलग करने में उच्च दक्षता है और oocytes को कम नुकसान है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस विधि को पूर्व-विटेलोजेनेसिस चरण सहित प्रारंभिक चरण के रोम पर लागू किया जा सकता है। इस प्रकार, इस सरल विधि का उपयोग कूप कोशिकाओं और जेब्राफिश के ओसाइट्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
जेब्राफिश कशेरुकी विकास और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव है। जेब्राफिश ओवेरियन डेवलपमेंट 1 ,2,3के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अच्छे मॉडल के रूप में काम करसकताहै । मछली से लेकर स्तनधारियों तक विकास के दौरान ओवेरियन विकास की कई विशेषताएं संरक्षित हैं1,2. अन्य कशेरुकी के समान, जेब्राफिश वयस्कों में अतुल्णीय अंडाशय होते हैं, जिनमें सभी विकासात्मक चरणों के अंडाशय के रोम होते हैं4। कूप अंडाशय का मौलिक प्रजनन तत्व है। कूप में ओसाइट होता है जो दैहिक कोशिकाओं की एक या कई परतों से घिरा होता है जिसे कूप कोशिकाएं कहा जाता है। रोम का विकास ओसाइट्स और कूप कोशिकाओं के बीच द्विदिशात्मक संचार पर निर्भर करता है5. कूप कोशिका प्राथमिक संस्कृति, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, ओसाइट परिपक्वता और इन विट्रो निषेचन जैसे विभिन्न शोध उद्देश्यों के लिए ओवेरियन रोम से कूप कोशिकाओं और ओसाइट्स को अलग करना महत्वपूर्ण है।
पारंपरिक पृथक्करण विधियों में बलदे और एंजाइमेटिक पाचन द्वारा यांत्रिक पृथक्करण शामिल हैं6,7,8,9,10. हालांकि, संदंश द्वारा यांत्रिक जुदाई समय लेने वाली और श्रमसाध्य है। यह भी जुदाई के दौरान ऊसाइट को अधिक नुकसान का कारण होगा। यद्यपि एंजाइम पाचन विधि संचालित करने के लिए सरल है और थोड़े समय की आवश्यकता होती है, उपचार समय और एंजाइम एकाग्रता को मान्य किया जाना चाहिए, और अलग-थलग ओसाइट्स की अखंडता और जीवित रहने की दर आदर्श नहीं है। इसलिए, हमने खींचे गए ग्लास केशिका ट्यूबों का उपयोग करके विभिन्न विकासात्मक चरणों में दोनों डिब्बों को अलग करने के लिए एक सरल विधि स्थापित की है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां ज़ेब्राफ़िश ओवेरियन रोम से कूप कोशिकाओं और ओसाइट्स के सरल और तेजी से पृथक्करण के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि पारंपरिक विधि पर कई फायदे हैं। इनमें से प्राथमिक उच्च दक्षता और प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन [32060170, 31601205 और 31560334] द्वारा समर्थित, चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित विद्वान परियोजना और मीठे पानी पारिस्थितिकी और जैव प्रौद्योगिकी की राज्य कुंजी प्रयोगशाला [2020FB05] द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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