Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish
Summary
Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.
Abstract
Zebrafish è diventato un modello ideale per studiare lo sviluppo ovarico dei vertebrati. Il follicolo è l’unità di base dell’ovaio, che consiste di ovociti e cellule follicolari circostanti. È fondamentale separare sia le cellule follicolari che gli ovociti per vari scopi di ricerca come per la coltura primaria di cellule follicolari, l’analisi dell’espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro, ecc. Il metodo convenzionale utilizza le forcep per separare entrambi i compartimenti, il che è laborioso, richiede molto tempo e ha alti danni all’ovocita. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti utilizzando un capillare in vetro tirato. Sotto uno stereomicroscopio, gli ovociti e le cellule follicolari possono essere facilmente separati mediante pipettazione in un capillare di vetro fine tirato (il diametro dipende dal diametro del follicolo). Rispetto al metodo convenzionale, questo nuovo metodo ha un’alta efficienza nella separazione sia degli ovociti che delle cellule follicolari e ha bassi danni agli ovociti. Ancora più importante, questo metodo può essere applicato ai follicoli in fase iniziale anche nella fase pre-vitellogenesi. Pertanto, questo semplice metodo può essere utilizzato per separare le cellule follicolari e gli ovociti del pesce zebra.
Introduction
Zebrafish è un importante organismo modello per lo studio dello sviluppo e della fisiologia dei vertebrati. Il pesce zebra può servire come un buon modello per lo studio dei meccanismi molecolari dello sviluppoovarico 1,2,3. Molte caratteristiche dello sviluppo ovarico sono molto conservate durante l’evoluzione dai pesci ai mammiferi1,2. Simile agli altri vertebrati, gli adulti zebrafish hanno ovaie asincrone, contenenti follicoli ovarico di tutte le fasi di sviluppo4. Il follicolo è l’elemento riproduttivo fondamentale dell’ovaio. Il follicolo è costituito dall’ovocitio che è circondato da uno o più strati di cellule somatiche chiamate cellule follicolari. Lo sviluppo dei follicoli dipende dalla comunicazione bidirezionale tra ovociti e cellule follicolari5. È fondamentale separare le cellule follicolari e gli ovociti dai follicoli ovarici per diversi scopi di ricerca come la coltura primaria delle cellule follicolari, l’analisi dell’espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro.
I metodi di separazione tradizionali includono la separazione meccanica mediante forcep e digestioneenzimatica 6,7,8,9,10. Tuttavia, la separazione meccanica per forcep è dispendiosa in termini di tempo e laboriosa. Causerà anche l’alto danno all’ovocita durante la separazione. Sebbene il metodo di digestione enzimatica sia semplice da usare e richieda un breve periodo di tempo, il tempo di trattamento e la concentrazione enzimatica devono essere convalidati e il tasso di integrità e sopravvivenza degli ovociti isolati non è l’ideale. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti in diversi stadi di sviluppo utilizzando tubi capillari in vetro tirato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un nuovo metodo per la semplice e rapida separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il principale di questi è la facilità di separazione notevolmente aumentata con alta efficienza ed efficacia, in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna. Questo punto aumenta l’applicabilità ai ricercatori che non sono bravi nell’anatomia microscopica. Secondo la nostra esperienza, si possono se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 e 31560334], progetto di visiting scholar sostenuto dal China Scholarship Council e dal fondo del Laboratorio chiave statale di ecologia e biotecnologia d’acqua dolce [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
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