얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리
Summary
여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.
Abstract
Zebrafish는 척추동물의 난소 발달을 연구하기에 이상적인 모델이 되었습니다. 여포는 난소와 주변 여포 세포로 구성된 난소의 기본 단위입니다. 여포 세포의 1차 배양, 유전자 발현 분석, 난낭 성숙및 체외 수정 등과 같은 다양한 연구 목적을 위해 여포 세포와 난미세포를 분리하는 것이 중요합니다. 종래의 방법은 집게를 사용하여 두 구획을 분리하는데, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 난소세포에 높은 손상을 줍니다. 여기서, 우리는 당겨진 유리 모세관을 사용하여 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 확립했습니다. 스테레오 현미경의 밑에, oocytes 및 여포 세포는 뽑아낸 미세 유리 모세관에서 파이펫으로 쉽게 분리될 수 있습니다 (직경은 여포 직경에 달려 있습니다). 종래의 방법에 비해, 이 새로운 방법은 난모세포와 여포 세포를 분리하는 데 있어서 고효율을 가지며 난모세포에 대한 손상이 낮습니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 사전 vitellogenesis 단계에서를 포함하여 초기 단계 여포에 적용될 수 있습니다. 따라서, 이 간단한 방법은 제브라피시의 여포 세포 및 난모세포를 분리하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
Zebrafish는 척추 동물 발달 및 생리학연구를 위한 주요 모형 유기체입니다. 제브라피쉬는 난소발달1,2,3의분자 메커니즘을 연구하는 좋은 모델이 될 수 있다. 난소 발달의 많은 특징은 물고기에서 포유류1,2로진화하는 동안 많이 보존된다. 다른 척추동물과 유사하게, 제브라피시 성인은 비동기 난소를 가지고 있으며, 모든 발달 단계4의난소 여포를 함유하고 있다. 여포는 난소의 기본 생식 요소입니다. 여포는 여포 세포에게 불린 체세포의 하나 또는 여러 층으로 포위되는 oocyte로 이루어져 있습니다. 여포의 발달은 난모세포와 여포 세포5사이의 양방향 통신에 의존한다. 여포 세포 원발문화, 유전자 발현 분석, 난소 성숙도 및 체외 수정과 같은 다른 연구 목적을 위해 난소 여포에서 여포와 난모세포를 분리하는 것이 중요합니다.
전통적인 분리 방법은 집게 및 효소소화6,7,8,9,10에의한 기계적분리를포함한다. 그러나, 집게에 의한 기계적 분리는 시간이 많이 걸리고 힘들다. 또한 분리 시 난소에 높은 손상을 입힙니다. 효소 소화 방법은 조작이 간단하고 짧은 시간이 필요하지만, 치료 시간과 효소 농도를 검증해야 하며, 고립된 난모세포의 무결성과 생존율은 이상적이지 않다. 따라서, 우리는 당겨진 유리 모세관 관을 사용하여 다른 발달 단계에서 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 설립했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 제브라피시 난소 여포에서 여포 세포와 난모세포의 간단하고 신속한 분리를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 종래의 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이들 중 1 차는 단일 및 외부 조작이 필요하므로 고효율 및 효과로 분리의 용이성을 크게 증가시다. 이 점은 현미경 해부학에 좋지 않은 연구원에 대한 적용성을 증가시킵니다. 우리의 경험에 따르면, 하나는 성공적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 작업은 중국 국립 자연과학 재단[32060170, 31601205 및 31560334]에 의해 지원되었으며, 중국 장학위원회가 지원하는 장학금 프로젝트와 담수 생태 및 생명공학 국가 핵심 연구소 기금 [2020FB05]에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. 발생학. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
