Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra
Summary
Aquí, presentamos un método simple para separar células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra, lo que facilitará las investigaciones del desarrollo ovárico en peces cebra.
Abstract
El pez cebra se ha convertido en un modelo ideal para estudiar el desarrollo ovárico de vertebrados. El folículo es la unidad básica del ovario, que consiste en ovocitos y células foliculares circundantes. Es vital separar tanto las células foliculares como los ocitos para diversos fines de investigación, tales como para el cultivo primario de células foliculares, análisis de la expresión génica, maduración de ocitos y fertilización in vitro, etc. El método convencional utiliza fórceps para separar ambos compartimentos, lo cual es laborioso, requiere mucho tiempo y tiene un alto daño al ócito. Aquí, hemos establecido un método simple para separar ambos compartimentos usando un capilar de vidrio tirado. Bajo un estereomicroscopio, los ócitos y las células foliculares se pueden separar fácilmente pipeteando en un capilar de vidrio fino tirado (el diámetro depende del diámetro del folículo). En comparación con el método convencional, este nuevo método tiene una alta eficiencia en la separación de ocitos y células foliculares y tiene un bajo daño a los ocitos. Más importante aún, este método se puede aplicar a los folículos en etapa temprana, incluso en la etapa previa a la vitellogénesis. Por lo tanto, este método simple se puede utilizar para separar las células foliculares y ocitos de pez cebra.
Introduction
El pez cebra es un organismo modelo importante para el estudio del desarrollo de vertebrados y la fisiología. El pez cebra puede servir como un buen modelo para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo ovárico1,2,3. Muchas características del desarrollo ovárico se conservan mucho durante la evolución de los peces a los mamíferos1,2. Al igual que los otros vertebrados, los adultos de pez cebra tienen ovarios asincrónicos, que contienen folículos ováricos de todas las etapas de desarrollo4. El folículo es el elemento reproductivo fundamental del ovario. El folículo consiste en el ócito que está rodeado por una o varias capas de células somáticas llamadas células foliculares. El desarrollo de folículos depende de la comunicación bidireccional entre ócitos y células foliculares5. Es vital separar las células foliculares y los ocitos de los folículos ováricos para diferentes propósitos de investigación como cultivo primario de células foliculares, análisis de expresión génica, maduración de ocitos y fertilización in vitro.
Los métodos de separación tradicionales incluyen separación mecánica por fórceps y digestión enzimática6,7,8,9,10. Sin embargo, la separación mecánica por fórceps requiere mucho tiempo y es laboriosa. También causará el alto daño al ócito durante la separación. Aunque el método de digestión enzimática es fácil de operar y requiere un corto tiempo, el tiempo de tratamiento y la concentración enzimática deben ser validados, y la integridad y la tasa de supervivencia de los ocitos aislados no son ideales. Por lo tanto, hemos establecido un método simple para separar ambos compartimentos en diferentes etapas de desarrollo utilizando tubos capilares de vidrio tirado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método novedoso para la separación simple y rápida de células foliculares y ocitos de folículos ováricos de pez cebra. Este método tiene varias ventajas sobre el método convencional. Primaria entre ellos está la mayor facilidad de separación con alta eficiencia y eficacia, ya que sólo se requiere una manipulación única y externa. Este punto aumenta la aplicabilidad a los investigadores que no son buenos en anatomía microscópica. Según nuestra experiencia, uno puede separar con éxito …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo de investigación fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [32060170, 31601205 y 31560334], proyecto académico visitante apoyado por el Consejo de Becas de China y el fondo del Laboratorio Clave estatal de Ecología y Biotecnología de Agua Dulce [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
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