Fluorescerende lækage assay til at undersøge membranen destabilisering af Cell-gennemtrængende peptid
Summary
Fluorescenslækageanalysen er en simpel metode, der gør det muligt at undersøge peptid / membraninteraktioner for at forstå deres involvering i flere biologiske processer og især evnen til cellegennemtrængende peptider for at forstyrre fosfolipider bilayers under en direkte cellulær translokationsproces.
Abstract
Cellegennemtrængende peptider (CPPs) defineres som bærere, der er i stand til at krydse plasmamembranen og overføre en last til celler. Et af de vigtigste fælles træk, der kræves for denne aktivitet, skyldes samspillet mellem HLPs med plasmamembranen (lipider) og især med komponenter i den ekstracellulære matrix af membranen selv (heparansulfat). Faktisk er lipid-bilayere uafhængigt af den direkte translokation eller den endokyoseafhængige internalisering involveret i internaliseringsprocessen både på plasmamembranniveau og på intracellulær trafikniveau (endosomale vesikler). I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver de forskellige trin i en stor unilamellar vesikler (LUVs) formulering, rensning, karakterisering og anvendelse i fluorescenslækageanalyse for at opdage mulig CPP-membran destabilisering / interaktion og for at adressere deres rolle i internaliseringsmekanismen. LUVs med en lipid sammensætning afspejler plasmamembran indhold genereres for at indkapsle både en fluorescerende farvestof og en quencher. Tilsætning af peptider i ekstravesicular medium og induktion af peptid-membran interaktioner på LUVs kan således fremkalde i en dosis-afhængig måde en betydelig stigning i fluorescens afslører en lækage. Eksempler er forsynet her med den nyligt udviklede tryptofan (W) – og arginin (R)-rige amphipatiske peptider (WRAPs), som viste en hurtig og effektiv siRNA levering i forskellige cellelinjer. Endelig diskuteres arten af disse interaktioner og affiniteten for lipider for at forstå og forbedre membrantranslokationen og / eller den endosomale flugt.
Introduction
Efter deres opdagelse i halvfemserne, celle-gennemtrængende peptider (CPPs) blev udviklet til at fremme en effektiv cellulær levering af laster gennem plasmamembranen1,2. CPC’er er normalt korte peptider, generelt 8 til 30 aminosyrer, der har en bred vifte af oprindelse. De blev først defineret som “direkte translocating” luftfartsselskaber, hvilket betyder, at de var i stand til at krydse plasmamembranen og overføre en last til celler uafhængigt af enhver endocytotisk vej hverken energibehov eller receptor involvering. Yderligere undersøgelser viste imidlertid , at disse første observationer hovedsagelig kom fra overvurdering af fluorescens på grund af den eksperimentelle artefakt og/eller fikseringsprotokoller ved hjælp af methanol3. I dag er det almindeligt accepteret, at CPP-optagelse finder sted ved både endokytose og energiuafhængig translokation4,5,6,7 afhængigt af forskellige parametre såsom lastens art, den anvendte forbindelse mellem CPP og last, den undersøgte cellelinje osv.
CAP’er kan anvendes som transfectionmidler i henhold til to strategier, der enten involverer en kemisk forbindelse (kovalent strategi) eller elektrostatiske/hydrofobiske interaktioner (ikke-kovalent strategi) mellem CPP og dets last8,9,10,11. Selv om begge strategier har vist deres effektivitet i celleoverførsel af flere laster, forståelsen af mekanismen for internalisering af CPPs er stadig under kontroverser, og balancen mellem endokytose veje eller direkte penetration er stadig vanskeligt at måle12,13. Selv om der findes et sæt eksperimentelle værktøjer og strategier til klart at håndtere inddragelsen af endoytiske processer, synes den direkte translokation imidlertid vanskeligere at karakterisere, da det indebærer mere diskrete interaktioner med plasmamembrankomponenter. Biologiske membraner består normalt af mange komponenter, fra fosfolipider til membranproteiner, som kan variere afhængigt af celletypen og / eller miljøet (stressforhold, celledeling osv.). Denne mangfoldighed af sammensætning, og dermed fraværet af en universel cellulær membran model ikke muliggør undersøgelser på en enkelt måde. Men for at omgå disse begrænsninger trin-for-trin tilgange blev udviklet med kunstige membran eller membran ekstrakter. Fra små unilamellar vesikler til monolayer tilgange, hver model var klart relevant at besvare specifikke spørgsmål14,15. Blandt dem udgør store unilamellar vesikler (LUVs) en passende membran efterligne model til at studere peptid / membran interaktioner som et centralt punkt i internaliseringsprocessen.
I den forbindelse beskriver følgende protokol undersøgelsen af virkningerne af peptider og peptid/membraninteraktioner på LUVs-integritet gennem overvågning af både et anionisk fluorescerende farvestof og dets tilsvarende polykationiske quencher indkapslet i liposomer. Dette værktøj bruges til at studere CPP/membraninteraktioner for at forstå, om de er i stand til at udføre en direkte membrantranslokation. Selvom det normalt anvendes til at sammenligne forskellige membran-interagerende peptider, denne LUV fluorescens lækage assay kunne også bruges til at undersøge både CPPs-last konjugere (kovalent strategi) og CPP: fragt komplekser (ikke-kovalent strategi).
Den nuværende protokol vil derfor først blive eksemplificeret med den nyligt udviklede tryptofan (W) – og arginin (R)-rige amphipatiske Peptider (WRAP)16. WRAP er i stand til at danne peptidbaserede nanopartikler til hurtigt og effektivt at levere små forstyrrende RNA (siRNA) i flere cellelinjer16. Fluorescenslækageegenskaberne for WRAP peptid alene eller siRNA-loaded WRAP-baserede nanopartikler blev overvåget for at karakterisere deres mekanisme for cellulær internalisering. Vi viste, at deres internaliseringsmekanisme hovedsagelig involverede direkte translokation7. I et andet eksempel blev WRAP peptid kovalent konjugeret til protein / protein interfererende peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 og dens evne til at destabilisere membraner blev sammenlignet i en fluorescens lækage assay til iCAL36 koblet til Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), en anden CPP.
Endelig vil metodens fordele og begrænsninger blive drøftet både ud fra et teknologisk synspunkt og med hensyn til biologisk relevans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede fluorescens lækage assay er en enkel og hurtig metode til at løse membran destabilisering af celle-gennemtrængende peptid. Let at gøre, det giver også mulighed for en indirekte sammenligning mellem forskellige membran-interagerende peptider eller andre membran-interagerende molekyler. Med hensyn til kritiske trin i protokollen, da denne analyse giver relative værdier mellem baseline (LUVs alene) og maksimal fluorescens frigivelse (Triton tilstand), vi normalt evaluere koncentrationen af LUVs ved h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Emilie Josse for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af fonden “La Ligue contre le Cancer”, “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer” og “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -. Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently “Wrap ‘n Roll” siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O’Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. 생화학. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. 생화학. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers – the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
