Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid
Summary
Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.
Abstract
Zelldurchdringende Peptide (CPPs) sind definiert als Träger, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen. Eines der wichtigsten gemeinsamen Merkmale, die für diese Aktivität erforderlich sind, ergab sich aus den Wechselwirkungen von CPPs mit der Plasmamembran (Lipide) und insbesondere mit Komponenten der extrazellulären Matrix der Membran selbst (Heparansulfat). Unabhängig von der direkten Translokation oder der endozytoseabhängigen Internalisierung sind Lipiddoppelschichten sowohl auf Der Ebene der Plasmamembran als auch auf der Ebene des intrazellulären Verkehrs (endosomale Vesikel) am Internalisierungsprozess beteiligt. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die verschiedenen Schritte der Formulierung, Reinigung, Charakterisierung und Anwendung eines großen unilamellaren Vesikels (LUVs) beschreibt, um eine mögliche CPP-Membrandestabilisierung / -interaktion zu erkennen und ihre Rolle im Internalisierungsmechanismus zu adressieren. LUVs mit einer Lipidzusammensetzung, die den Plasmamembrangehalt widerspiegelt, werden erzeugt, um sowohl einen Fluoreszenzfarbstoff als auch einen Quencher zu verkapseln. Die Zugabe von Peptiden im extravesikulären Medium und die Induktion von Peptid-Membran-Wechselwirkungen auf den LUVs könnten somit dosisabhängig eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz induzieren, die eine Leckage aufdeckt. Hier werden Beispiele mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen amphipathischen Peptiden (WRAPs) geliefert, die eine schnelle und effiziente siRNA-Abgabe in verschiedenen Zelllinien zeigten. Schließlich werden die Art dieser Wechselwirkungen und die Affinität zu Lipiden diskutiert, um die Membrantranslokation und/oder den endosomalen Entweicher zu verstehen und zu verbessern.
Introduction
Nach ihrer Entdeckung in den neunziger Jahren wurden zelldurchdringende Peptide (CPPs) entwickelt, um eine effiziente zelluläre Lieferung von Ladungen durch die Plasmamembran zu fördern1,2. CPPs sind in der Regel kurze Peptide, im Allgemeinen 8 bis 30 Aminosäuren, die eine Vielzahl von Ursprüngen haben. Sie wurden zunächst als “direkt translozierende” Träger definiert, was bedeutet, dass sie in der Lage waren, die Plasmamembran zu überqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen, unabhängig von einem endozytotischen Weg, weder Energiebedarf noch Rezeptorbeteiligung. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese ersten Beobachtungen hauptsächlich auf eine Fluoreszenzüberschätzung aufgrund des experimentellen Artefakts und/oder auf Fixierungsprotokolle mit Methanol3 zurückzuführen waren. Heutzutage ist es allgemein anerkannt, dass die CPP-Aufnahme sowohl durch Endozytose als auch durch energieunabhängige Translokation4,5,6,7 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie der Art der Ladung, der verwendeten Verbindung zwischen CPP und Ladung, der untersuchten Zelllinie usw. erfolgt.
CPPs können als Transfektionsmittel nach zwei Strategien verwendet werden, entweder mit einer chemischen Verbindung (kovalente Strategie) oder elektrostatisch/hydrophobe Wechselwirkungen (nicht-kovalente Strategie) zwischen dem CPP und seiner Ladung8,9,10,11. Obwohl beide Strategien ihre Effizienz beim Zelltransfer mehrerer Ladungen gezeigt haben, ist das Verständnis des Mechanismus der Internalisierung durch CPPs immer noch umstritten und das Gleichgewicht zwischen Endozytosewegen oder direkter Penetration ist immer noch schwer zu messen12,13. Obwohl eine Reihe von experimentellen Werkzeugen und Strategien zur Verfügung stehen, um die Beteiligung endozytärer Prozesse klar zu adressieren, scheint die direkte Translokation jedoch schwieriger zu charakterisieren, da sie diskretere Wechselwirkungen mit Plasmamembrankomponenten impliziert. Biologische Membranen bestehen in der Regel aus zahlreichen Komponenten, von Phospholipiden bis hin zu Membranproteinen, die je nach Zelltyp und/oder Umgebung (Stressbedingungen, Zellteilung usw.) variieren können. Diese Vielfalt der Zusammensetzung und folglich das Fehlen eines universellen zellulären Membranmodells ermöglicht keine Studien in einer einzigen Weise. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden jedoch schrittweise Ansätze mit künstlichen Membranen oder Membranextrakten entwickelt. Von kleinen unilamellaren Vesikeln bis hin zu Monolayer-Ansätzen war jedes Modell eindeutig relevant, um spezifische Fragen zu beantworten14,15. Unter ihnen bilden große unilamellare Vesikel (LUVs) ein geeignetes Membranimitationsmodell, um Peptid/ Membran-Wechselwirkungen als Schlüsselpunkt im Internalisierungsprozess zu untersuchen.
In diesem Zusammenhang beschreibt das folgende Protokoll die Untersuchung der Auswirkungen von Peptiden und Peptid/Membran-Wechselwirkungen auf die Integrität von LUVs durch die Überwachung sowohl eines anionischen Fluoreszenzfarbstoffs als auch seines entsprechenden polykationischen Quenchers, der in Liposomen verkapselt ist. Dieses Tool wird verwendet, um CPP / Membran-Interaktionen zu untersuchen, um zu verstehen, ob sie in der Lage sind, eine direkte Membrantranslokation durchzuführen. Obwohl dieser LUV-Fluoreszenzleckage-Assay normalerweise zum Vergleich verschiedener membranwechselwirkender Peptide angewendet wird, könnte er auch zur Untersuchung von CPPs-Frachtkonjugaten (kovalente Strategie) und CPP:cargo-Komplexen (nicht-kovalente Strategie) verwendet werden.
Das vorliegende Protokoll wird daher erstmals exemplarisch mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen Amphipathischen Peptiden (WRAP)16 veranschaulicht. WRAP ist in der Lage, peptidbasierte Nanopartikel zu bilden, um schnell und effizient kleine interferierende RNA (siRNA) in mehreren Zelllinien zu liefern16. Die Fluoreszenzleckeigenschaften von WRAP-Peptid allein oder siRNA-beladenen WRAP-basierten Nanopartikeln wurden überwacht, um ihren Mechanismus der zellulären Internalisierung zu charakterisieren. Wir zeigten, dass ihr Internalisierungsmechanismus hauptsächlich direkte Translokationbeinhaltete 7. In einem zweiten Beispiel wurde das WRAP-Peptid kovalent mit dem Protein/Protein-interferierenden Peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 konjugiert und seine Fähigkeit, Membranen zu destabilisieren, in einem Fluoreszenzleckage-Assay mit iCAL36 verglichen, das mit Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), einem weiteren CPP, gekoppelt ist.
Abschließend werden die Vorteile und Grenzen der Methode sowohl aus technologischer Sicht als auch im Hinblick auf die biologische Relevanz diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der vorgestellte Fluoreszenzlecktest ist eine einfache und schnelle Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid. Einfach zu machen, ermöglicht es auch einen indirekten Vergleich zwischen verschiedenen membranwechselwirkenden Peptiden oder anderen membraninteragierenden Molekülen. In Bezug auf kritische Schritte des Protokolls, da dieser Assay relative Werte zwischen der Baseline (LUVs allein) und der maximalen Fluoreszenzfreisetzung (Triton-Bedingung) liefert, bewerten wir normal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Emilie Josse für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Stiftung “La Ligue contre le Cancer”, der “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer” und dem “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS) unterstützt.
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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