דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים
Summary
בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.
Abstract
פפטידים חודרי תאים (CPPs) מוגדרים כנשאים המסוגלים לחצות את קרום הפלזמה ולהעביר מטען לתאים. אחד המאפיינים הנפוצים העיקריים הנדרשים לפעילות זו נבע אינטראקציות של CPPs עם קרום הפלזמה (שומנים) ובמיוחד עם מרכיבים של מטריצה חוץ תאית של הממברנה עצמה (הפרין סולפט). ואכן, ללא תלות בטרנסלוקציה הישירה או הפנמה תלוית אנדוציטוזיס, bilayers השומנים מעורבים בתהליך ההפנמה הן ברמת קרום הפלזמה והן ברמה של תנועה תאית (שלפוחיות אנדוסומליות). במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השלבים השונים של שלפוחיות חד-צדדיות גדולות (LUVs) ניסוח, טיהור, אפיון ויישום בדליפת פלואורסצנטיות על מנת לזהות חוסר היציבות / אינטראקציה אפשריים של קרום CPP ולטפל בתפקידם במנגנון ההפנמה. LUVs עם הרכב שומנים המשקף את תוכן קרום פלזמה נוצרים על מנת לתמצת הן צבע פלואורסצנטי ו quencher. תוספת של פפטידים במדיום החוץ-לימודי וגיוס של אינטראקציות פפטיד-קרום על LUVs עשוי לגרום באופן תלוי מינון עלייה משמעותית פלואורסצנטיות חושף דליפה. דוגמאות מסופקות כאן עם טריפטופן שפותח לאחרונה (W)- וארגינין (R)פפטידים אמפתיים עשירים (WRAPs), אשר הראו משלוח siRNA מהיר ויעיל בשורות תאים שונים. לבסוף, אופי האינטראקציות האלה ואת הזיקה של שומנים נדונים כדי להבין ולשפר את טרנסלוקציה הממברנה ו / או את הבריחה האנדוסומית.
Introduction
לאחר גילוים בשנות התשעים, פפטידים חודרי תאים (CPPs) פותחו כדי לקדם משלוח סלולרי יעיל של מטענים דרך קרום הפלזמה1,2. CPPs הם בדרך כלל פפטידים קצרים, בדרך כלל 8 עד 30 חומצות אמינו, בעל מגוון רחב של מקורות. הם הוגדרו תחילה כנשאים “טרנסלוקציה ישירה”, כלומר הם הצליחו לחצות את קרום הפלזמה ולהעביר מטען לתאים ללא תלות בכל מסלול אנדוציטוטי לא דרישת אנרגיה ולא מעורבות קולטן. עם זאת, חקירות נוספות גילו כי תצפיות ראשונות אלה הגיעו בעיקר מהערכת יתר פלואורסצנטית בשל החפץ הניסיוני ו / או לפרוטוקולי קיבעון באמצעות מתנול3. כיום, מקובל כי ספיגת CPP מתרחשת הן על ידי אנדוציטוזיס והן טרנסלוקציה עצמאיתלאנרגיה 4,5,6,7 בהתאם לפרמטרים שונים כגון אופי המטען, הקשר המשומש בין CPP למטען, קו התא הנחקר וכו ‘.
CPPs יכול לשמש כסוכני transfection על פי שתי אסטרטגיות, או מעורבים קישור כימי (אסטרטגיה covalent) או אינטראקציות אלקטרוסטטיות / הידרופוביות (אסטרטגיה לא קוולנטית) בין CPP למטען שלה8,9,10,11. למרות ששתי האסטרטגיות הראו את יעילותן בהעברת תאים של מספר מטענים, הבנת מנגנון ההפנמה על ידי CPPs עדיין נמצאת במחלוקת והאיזון בין מסלולי אנדוציטוזיס או חדירה ישירה עדיין קשה למדוד12,13. למרות קבוצה של כלים ניסיוניים ואסטרטגיות זמינים כדי לטפל בבירור במעורבות של תהליכים אנדוציטיים, טרנסלוקציה ישירה נראה, עם זאת, קשה יותר לאפיין שכן הוא מרמז על אינטראקציות דיסקרטיות יותר עם רכיבי קרום פלזמה. ממברנות ביולוגיות מורכבות בדרך כלל מרכיבים רבים, מפוספוליפידים ועד חלבוני ממברנה, אשר עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא ו /או לסביבה (תנאי לחץ, חלוקת תאים וכו ‘). מגוון זה של הרכב, וכתוצאה מכך היעדר מודל ממברנה תאית אוניברסלי אינו מאפשר מחקרים באופן אחד. עם זאת, כדי לעקוף מגבלות אלה צעד אחר צעד גישות פותחו עם תמציות ממברנה מלאכותית או ממברנה. משלשלות חד-צדדיות קטנות ועד גישות של מונו-שכבתיות, כל דגם היה רלוונטי בבירור לענות על שאלות ספציפיות14,15. ביניהם, שלל חד-צדדי גדול (LUVs) מהווים מודל חיקוי ממברנה מתאים לחקר אינטראקציות פפטיד / ממברנה כנקודת מפתח בתהליך ההפנמה.
בהקשר זה, הפרוטוקול הבא מתאר את חקירת ההשפעות של פפטידים ואינטראקציות פפטיד / ממברנה על שלמות LUVs באמצעות ניטור של צבע פלואורסצנטי אניוני שלה ואת quencher פולי-cationic המקביל שלה encapsulated ליפוזומים. כלי זה משמש לחקר אינטראקציות CPP / ממברנה על מנת להבין אם הם מסוגלים לבצע טרנסלוקציה ממברנה ישירה. למרות שבדרך כלל מיושם כדי להשוות פפטידים שונים אינטראקציה ממברנה, זה LUV פלואורסצנטי דליפת אסאי יכול לשמש גם לחקירת מצומדים מטען CPPs (אסטרטגיה covalent) ו- CPP:מתחמי מטען (אסטרטגיה לא covalent).
הפרוטוקול הנוכחי יתבטא תחילה עם טריפטופן שפותח לאחרונה (W)- וארגינין (R) פפטידים אמפתיים עשירים (WRAP)16. WRAP מסוגל ליצור חלקיקים מבוססי פפטיד כדי לספק במהירות וביעילות RNA מפריע קטן (siRNA) בכמה קווי תאים16. תכונות דליפת הפלואורסצנטיות של פפטיד WRAP לבד או חלקיקים מבוססי WRAP טעונים siRNA היו מנוטרים כדי לאפיין את מנגנון ההפנמה התאית שלהם. הראינו שמנגנון ההפנמה שלהם כלל בעיקר טרנסלוקציה ישירה7. בדוגמה שנייה, פפטיד WRAP היה מצומד באופן קוולנטי לחלבון / חלבון מפריע פפטיד iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 ואת יכולתו לערער את הממברנות הושווה בדליפת פלואורסצנטית assay ל iCAL36 בשילוב חדירה18 (חדירה-iCAL36), CPP אחר.
לבסוף, היתרונות והמגבלות של השיטה יידונו הן מבחינה טכנולוגית והן ביחס לשל רלוונטיות ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות המוצגת היא שיטה פשוטה ומהירה לטיפול בערערת הממברנה על ידי פפטיד חודר תאים. קל לעשות, זה גם מאפשר השוואה עקיפה בין פפטידים שונים אינטראקציה ממברנה או מולקולות אחרות אינטראקציה ממברנה. לגבי צעדים קריטיים של הפרוטוקול, כמו בדיקת זה מספקת ערכים יחסיים בין הבסיס (LUVs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאמילי ג’וסה על הביקורת הביקורתית על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן “La Ligue contre le Cancer”, “Fondation ARC לשפוך la Recherche sur le Cancer”, ואת “המרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -. Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently “Wrap ‘n Roll” siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O’Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. 생화학. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. 생화학. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers – the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
