Fluorescerande läckageanalys för att undersöka membranstabilisering av cellgenomträngande peptid
Summary
Fluorescensläckageanalysen är en enkel metod som möjliggör undersökning av peptid/membraninteraktioner för att förstå deras engagemang i flera biologiska processer och särskilt förmågan hos cellgenomträngande peptider att störa fosfolipider bilayers under en direkt cellulär flyttningsprocess.
Abstract
Cellgenomträngande peptider (CPPs) definieras som bärare som kan korsa plasmamembranet och överföra en last till celler. En av de viktigaste gemensamma funktionerna som krävs för denna aktivitet härrörde från interaktioner av CPPs med plasmamembranet (lipider) och särskilt med komponenter i den extracellulära matrisen i membranet själv (heparansulfat). Oberoende av den direkta flyttningen eller endocytosisberoende internalisering är lipidbilayers involverade i internaliseringsprocessen både på plasmamembranets nivå och på nivån för intracellulär trafik (endosomala blåsor). I den här artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver de olika stegen i en stor unilameller vesiklar (LUVs) formulering, rening, karakterisering och tillämpning i fluorescens läckage analys för att upptäcka möjliga CPP-membran destabilisering/interaktion och att ta itu med deras roll i internalisering mekanismen. LUVs med en lipidkomposition som återspeglar plasmamembranhalten genereras för att kapsla in både ett fluorescerande färgämne och en quencher. Tillsats av peptider i det extravesikulära mediet och induktion av peptidmembraninteraktioner på LUV kan således på ett dosberoende sätt inducera en betydande ökning av fluorescens som avslöjar ett läckage. Exempel ges här med den nyligen utvecklade tryptofan (W)- och arginin (R)-rika amfipatiska peptider (WRAPs), som visade en snabb och effektiv siRNA-leverans i olika cellinjer. Slutligen diskuteras arten av dessa interaktioner och affiniteten för lipider för att förstå och förbättra membran flyttning och/eller endosomal flykt.
Introduction
Efter deras upptäckt på nittiotalet utvecklades cellgenomträngande peptider (CPPs) för att främja en effektiv cellulär leverans av laster genom plasmamembranet1,2. CPPs är vanligtvis korta peptider, i allmänhet 8 till 30 aminosyror, med en mängd olika ursprung. De definierades först som “direkt-flyttande” bärare, vilket innebär att de kunde korsa plasmamembranet och överföra en last till celler oberoende av någon endocytotisk väg varken energibehov eller receptor engagemang. Ytterligare undersökningar visade dock att dessa första observationer huvudsakligen kom från fluorescensöverskattning på grund av experimentell artefakt och/eller fixeringsprotokoll med metanol3. Numera är det allmänt accepterat att CPP-upptag sker genom både endocytos och energioberoende flyttning4,5,6,7 beroende på olika parametrar som lastens natur, den använda länken mellan CPP och last, den studerade cellinjen etc.
CPPs kan användas som transfekteringsmedel enligt två strategier, antingen med en kemisk länk (kovalent strategi) eller elektrostatiska/hydrofoba interaktioner (icke-kovalent strategi) mellan CPP och dess last8,9,10,11. Även om båda strategierna har visat sin effektivitet i cellöverföringen av flera laster, är förståelsen av mekanismen för internalisering av CPPs fortfarande under kontrovers och balansen mellan endocytosvägar eller direkt penetration är fortfarande svår att mäta12,13. Även om en uppsättning experimentella verktyg och strategier är tillgängliga för att tydligt ta itu med engagemanget av endocytiska processer, verkar den direkta flyttning dock svårare att karakterisera eftersom det innebär mer diskreta interaktioner med plasma membran komponenter. Biologiska membran består vanligtvis av många komponenter, från fosfolipider till membranproteiner, som kan variera beroende på celltyp och/eller miljö (stressförhållanden, celldelning etc.). Denna mångfald av sammansättning, och följaktligen frånvaron av en universell cellulär membranmodell möjliggör inte studier på ett enda sätt. För att kringgå dessa begränsningar steg-för-steg metoder utvecklades dock med konstgjorda membran eller membran extrakt. Från små unilameller vesiklar till monolayer-metoder var varje modell tydligt relevant för att svara på specifika frågor14,15. Bland dem utgör stora unilameller vesiklar (LUVs) en lämplig membran härma modell för att studera peptid / membran interaktioner som en nyckelpunkt i internaliseringsprocessen.
I detta sammanhang beskriver följande protokoll undersökningen av effekterna av peptider och peptid/membran interaktioner på LUVs integritet genom övervakning av både en anjonisk fluorescerande färgämne och dess motsvarande poly-katjonic quencher inkapslad i liposomer. Detta verktyg används för att studera CPP/ membraninteraktioner för att förstå om de kan utföra en direkt membranflyttning. Även om det vanligtvis tillämpas för att jämföra olika membran-interagerande peptider, kan denna LUV fluorescensläckageanalys också användas för att undersöka både CPPs-cargokonjugat (kovalent strategi) och CPP: lastkomplex (icke-kovalent strategi).
Det nuvarande protokollet kommer därför först att exemplifieras med de nyligen utvecklade tryptofan (W)- och arginin (R)-rika amfipatiska peptider (WRAP)16. WRAP kan bilda peptidbaserade nanopartiklar för att snabbt och effektivt leverera små störande RNA (siRNA) i flera cellinjer16. Fluorescensläckage egenskaper av WRAP peptid ensam eller siRNA-laddade WRAP-baserade nanopartiklar övervakades för att karakterisera deras mekanism för cellulär internalisering. Vi visade att deras interniseringsmekanism huvudsakligen involverade direkt flyttning7. I ett andra exempel var WRAP peptiden kovalent konjugerad till proteinet/protein störande peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 och dess förmåga att destabilisera membran jämfördes i en fluorescens läckageanalys till iCAL36 kopplad till Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), en annan CPP.
Slutligen kommer metodens fördelar och begränsningar att diskuteras både ur teknisk synvinkel och med avseende på biologisk relevans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade fluorescensläckageanalysen är en enkel och snabb metod för att ta itu med membran destabilisering genom cellgenomträngande peptid. Lätt att göra, det möjliggör också en indirekt jämförelse mellan olika membran-interagerande peptider eller andra membran-interagerande molekyler. När det gäller kritiska steg i protokollet, eftersom denna analys ger relativa värden mellan baslinjen (LUVs ensam) och maximal fluorescens release (Triton villkor), utvärderar vi vanligtvis koncentrationen av LUV me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Emilie Josse för den kritiska granskningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av stiftelsen “La Ligue contre le Cancer”, “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer” och “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -. Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently “Wrap ‘n Roll” siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O’Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. 생화학. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. 생화학. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers – the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
